大建中汤对术后肠梗阻大鼠胃肠功能的影响

马亦湘,王胜兰,周春宇,杨成城,张 栋,钱嘉惠,王馨悦,张少辉

(1. 北京中医药大学,北京 100029;2. 北京中医药大学东方医院,北京 100078)

术后肠梗阻是临床上外科腹部手术对胃肠道的非机械性刺激引起的一种常见的术后并发症,主要表现有肠内容物无法排出、腹痛、腹胀、呕吐。目前认为术后肠梗阻的发病原因包括手术创伤的程度、手术前后药物的干扰(止痛药、麻醉药、抗生素等的使用)、电解质紊乱和炎症反应等[1]。近年来,随着快速康复外科理念在临床上的应用价值受到广泛重视,术后肠梗阻因延长患者住院时间、增加住院费用、严重影响患者生活质量而备受重视,因此促进术后胃肠功能恢复作为快速康复外科中的核心内容受到重点关注[2]。大建中汤是中医经方,是针对中焦虚寒的代表方,近年来广泛用于术后肠梗阻、肠易激综合征、功能性便秘、克罗恩病、缺血性肠病、结肠功能障碍等的治疗。日本企业将大建中汤简化配方制成标准化提取颗粒,其是为数不多经美国药品食品管理局(FDA)批准进入临床试验的成方,在胃肠外科领域进行了大量研究[3-4],证实该方具有抗炎、改善消化道微循环、维持肠黏膜屏障、促进肠道运动等作用[5-6]。本实验旨在通过观察大建中汤灌胃后术后肠梗阻大鼠胃肠运动、肠黏膜屏障、炎症因子及胃肠激素水平等的变化,进一步探讨大建中汤对术后肠梗阻胃肠功能的影响,以期为临床应用提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠40只,体重(200±20)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号:SCXK(京2016-0011)。饲养于北京中医药大学东方医院动物实验室中(SPF级),室温控制在(22 ± 2) ℃,相对湿度保持在50%～60%,光照保持正常昼夜节律,并且饲养环境保持安静。分笼饲养,每日自由饮食、饮水。本实验通过北京中医药大学东方医院伦理委员办公室审批(DFYY202114R)。

1.2药物与试剂 大建中汤颗粒制剂(由蜀椒、干姜、人参、饴糖组成)购自北京上医仁家中医诊所有限公司,饴糖由北京德寿堂医药有限公司所制。血管活性肠肽(VIP)、分泌型免疫球蛋白(sIgA)、白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA检测试剂盒购自广州瑞博奥生物科技有限公司。通用型4%组织固定液、苏木素染液、切片石蜡购自北京百诺威生物科技有限公司。蓝色葡聚糖2000购自北京百瑞极生物科技有限公司。阿佛丁、叔戊醇购自北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.3相关溶液的配制

1.3.1麻醉剂 在5 g阿佛丁瓶内加3.1 mL叔戊醇,震荡溶解,铝膜包裹室温保存储液。取3 mL储存液,加入159 mL生理盐水室温震荡混合10 min,0.22 μm过滤后4 ℃保存。

1.3.2肠道指示剂 称取0.4 g蓝色葡聚糖2000固体粉末,加入20 mL生理盐水充分溶解配制成2%蓝色葡聚糖2000溶液。

1.3.3大建中汤溶液 根据古今用药度量衡考证,经文献查询后,参考现代临床应用剂量拟定大建中汤组方用蜀椒6 g、干姜12 g、人参6 g、饴糖30 g,参照动物体表面积比率换算大鼠的等效剂量。70 kg成年人每日有效剂量是108 g,即771.4 mg/kg,已知人每千克的用药量,参考《中药药理实验方法学》[7]中人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值,大鼠灌胃剂量(g/kg)=771.4 mg/kg×70 kg×0.018/0.2 kg=4.86 g/kg,故200 g大鼠的用药剂量为0.972 g/d,按照每次10 mL/kg体重灌胃,将大建中汤颗粒剂稀释成0.486 g/mL的溶液(其中饴糖为烊化)。

1.4实验方法 按照随机数字法将雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、术后肠梗阻组、大建中汤组,每组10只,分笼饲养。参照Kalff造模方法[8],假手术组、术后肠梗阻组、大建中汤组均在麻醉后无菌条件下经大鼠腹正中线切开进入腹腔,术者双手不可接触腹腔内胃肠道,均以器械操作。造模方法:1.25%三溴乙醇腹腔注射麻醉满意后,将大鼠后仰卧置于手术台上,脱毛、消毒;沿腹白线打开腹腔,用无菌纱布洞巾置于大鼠腹部,2根生理盐水润湿的无菌棉签轻柔地将小肠肠段从腹腔移出置于纱布上,并从空肠近端(Treitz韧带处)到回肠末端来回滚动并轻柔挤压3次,共用时15 min;刺激完毕后将小肠回纳入腹腔,双层连续性缝合关闭腹腔;假手术组开腹后不干预肠管,其他操作同上。于术后6 h、12 h、24 h,大建中汤组按照10 mL/kg灌胃给予大建中汤颗粒剂,正常组、假手术组和模型组灌胃等容积生理盐水。

1.5检测指标与方法

1.5.1肠道形态及小肠推进率 处死前60 min,所有大鼠均灌胃0.4 mL 2%蓝色葡聚糖2000溶液,30 min后腹腔注射10 mL/kg的1.25%三溴乙醇溶液麻醉大鼠,开腹,结扎贲门、幽门和回盲部,取小肠平铺于用生理盐水润湿的试验台上,肉眼观察肠管的颜色、运动、有无粘连、溃疡及梗阻扩张等情况,然后自然拉直小肠,测量小肠全长和幽门至蓝色前沿距离,计算小肠推进率。小肠推进率=幽门括约肌至色素前沿距离/小肠全长×100%。

1.5.2肠组织病理形态 大鼠处死后取回肠末端约3 cm小肠组织,经乙醇脱水、透明、石蜡包埋、切片及苏木素-伊红(HE)染色等步骤后,用光学显微镜观察肠道组织病理形态。

1.5.3血清学指标水平 取VIP、sIgA、IL-1β ELISA检测试剂盒,按照说明书介绍的方法,加入100 μL相应抗体工作液至每个微孔中,在室温震荡孵育1.5 h,用洗涤液的工作液洗孔4次,加100 μL 标准溶液、100 μL 样品至相应的微孔中,室温震荡孵育2.5 h,洗孔4次,加入100 μL HRP标记的链酶亲和素工作液,室温孵育45 min,洗孔4次,加入100 μL底物溶液,避光,室温震荡孵育30 min,加入50 μL终止液,尽快用酶标仪在450 nm波长依序检测各孔的光密度值(OD)。

1.6统计学方法 所有获取的实验相关数据均使用SPSS 20.0统计软件分析。符合正态分布的计量数据多组间比较采用One-Way ANOVA方法,多重比较采用LSD法;不符合正态分布的计量数据采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠肉眼观察肠道形态 正常组与假手术组大鼠肠道颜色正常,未见明显出血点、溃疡创面及坏死灶,管径大小适中,肠管蠕动正常,肠管无明显粘连;术后肠梗阻组大鼠肠道颜色较正常组深,部分大鼠肠管表面有少量渗血点,肠壁水肿,肠腔内有气液聚积,肠蠕动稍差,部分大鼠肠管明显粘连、扩张;大建中汤组大鼠肠道颜色稍深,小肠轻度扩张,肠壁轻度水肿,有少量积气积液,较术后肠梗阻组程度明显减轻,无明显出血、溃疡,肠蠕动尚可。见图1。

图1 肉眼观察各组大鼠肠道形态

2.2各组大鼠小肠推进率 正常组与假手术组大鼠小肠推进率比较差异无统计学意义(P>0.05);术后24 h,术后肠梗阻组大鼠小肠推进率明显低于正常组及假手术组(P均<0.05),大建中汤组大鼠小肠推进率明显高于术后肠梗阻组 (P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠小肠推进率

2.3各组大鼠肠组织病理形态 正常组与假手术组大鼠肠黏膜上皮排列有序,绒毛结构清晰,组织结构正常;术后肠梗阻组大鼠肠黏膜损害明显,黏膜下充血水肿,绒毛萎缩变短、部分水肿变宽,间质可见炎性细胞浸润;大建中汤组大鼠肠道组织黏膜上皮排列较整齐,绒毛长短稍显不齐,间质轻度充血水肿,可见少量炎性细胞浸润,病理改变较模型组明显改善。见图3。

图3 各组大鼠肠组织病理切片表现

2.4各组大鼠血清VIP、sIgA及IL-1β水平 正常组与假手术组大鼠血清VIP、sIgA、IL-1β水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05);与正常组及假手术组比较,术后肠梗阻组大鼠血清VIP、IL-1β水平均明显升高(P均<0.05),血清sIgA水平均明显降低(P均<0.05);与术后肠梗阻组比较,大建中汤组大鼠血清VIP、IL-1β水平均明显降低(P均<0.05),血清sIgA水平明显升高(P<0.05)。见图4。

图4 各组大鼠血清VIP、sIgA、IL-1β水平

3 讨 论

结合术后肠梗阻的证候特点,中医一般将其归入“肠结”的范畴[9],其病位主要涉及中焦肠腑。对于术后肠梗阻的治疗,中医临床本着“六腑以通为用”的原则,常运用大承气汤“通里攻下”为大法,同时通过加减化裁,增益“活血行气止痛”的功效,以尽快恢复肠道“通”的功能。尽管针对术后肠梗阻应用承气类方疗效肯定,作用机制明确,但应用指征即证候分型较为严格和局限。在临床实践中,近年来针对术后患者的中医证候分布以及方证对应研究发现,腹部术后患者一方面由于手术创伤损伤气血,加之术后抗生素的使用,耗伤脾阳[10],气血损益更盛,表现为“虚”的特点;另一方面由于气机不畅败血浊瘀滞留肠腑,形成实邪困郁肠内,表现为“实”的特点,因此术后患者核心病机是本虚标实,其中气血虚衰为本虚,因虚累及中阳而致气滞血瘀、腑实肠结、胃气上逆诸证是标实。若一概使用承气辈的攻下之法更易损及人体正气,耗伤中焦阳气,不利于术后患者的肠道功能恢复。本着辨证论治、方证对应的中医治疗核心,术后扶正祛邪、以扶正为本的温中补虚之法已经受到临床关注[11]。

大建中汤方出自《金匮要略》的第十篇,原文所述:“心中大寒痛,呕不能饮食,腹中寒,上冲皮起出见有头足,上下痛而不可触近,大建中汤主之。”说明了大建中汤所主诸症,其一为大寒痛,二为呕不能饮食,三为上冲皮起,这与术后肠梗阻所出现的腹痛腹冷、恶心呕吐、腹胀以及肠型等临床表现具有较高的一致性。方中蜀椒温补中阳,散寒止痛,为君药。以干姜之辛热以温中散寒,另助蜀椒散寒之力;饴糖温补中虚,缓急止痛,助蜀椒止痛之功,共为臣药。人参补脾益气,配合饴糖重建中焦脾胃,为佐药。诸药合用,共奏温阳散寒补虚、建中通腑止痛之功。现代药理学研究表明人参可维护肠黏膜屏障功能,减轻肠壁肌层炎症,防止胃肠运动功能进一步受损[12]。干姜具有抗氧自由基、抑制脂质过氧化损伤和改善微循环的作用[13-15]。花椒挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌具有较强抑制作用,且低浓度的花椒挥发油对离体小肠、结肠平滑肌有兴奋作用[16]。

术后肠梗阻的发生与手术创伤的程度、麻醉用药、术后疼痛控制、抗生素的应用、炎症反应、应激等有关,其发病机制复杂,目前普遍认为术后肠梗阻的发生发展先后经历了神经机制及炎症机制的依次主导。术后肠梗阻的第一阶段大约发生于手术开始到术后3 h内,主要由神经反射机制介导;第二阶段始于术后3～4 h,持续时间长,主要由炎症机制介导,此期对胃肠动力影响较大,是临床防治的重点和难点[17-18]。手术的肠操作激活肥大细胞,引起肌层的炎症因子如IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF-α)等趋化和释放,肠道肌层出现炎症细胞浸润,损害胃肠功能,并通过炎症级联反应及神经免疫内分泌机制传导将胃肠功能障碍扩展到整个胃肠道[19-20],期间伴随着胃肠激素分泌紊乱、肠道免疫功能损害、局部神经递质释放传递失衡以及肠道菌群移位等病理变化,这些病理变化互为因果,恶性循环,加重胃肠功能障碍。因此,本研究采用经典的小肠干扰术建立术后肠梗阻大鼠模型,通过观察胃肠激素、免疫功能以及炎症反应指标,探讨大建中汤对术后肠梗阻大鼠胃肠功能的影响及可能机制。

VIP是一种抑制性胃肠激素,在神经免疫内分泌网络中扮演重要角色,可以通过多种方式调节胃肠道的分泌、运动、吸收和消化功能。VIP可以抑制胃肠运动,降低十二指肠收缩频率,松弛结肠平滑肌,减弱结肠运动;还可以与肥大细胞表面的受体结合,激活肥大细胞,诱使炎症因子趋化,参与免疫调节过程,进而通过多种途径影响局部肠黏膜屏障[21-22]。在本实验中,经小肠干扰术造模后,大鼠小肠推进率明显降低,血清VIP水平明显升高;大建中汤组大鼠小肠推进率明显高于术后肠梗阻组,血清VIP水平明显低于术后肠梗阻组。这表明大建中汤可以降低术后肠梗阻大鼠血清VIP水平,在一定程度上增强胃肠运动,改善术后肠梗阻大鼠的胃肠功能。

sIgA是肠黏膜相关淋巴组织产生的免疫球蛋白,其可以清除抗原,维持免疫系统的稳定,是维持肠黏膜稳态的一道重要防线。此外,sIgA可以刺激肠道黏液分泌并加速黏液层的流动,阻碍黏附素与上皮细胞的相互作用,有效阻止细菌对肠黏膜的黏附,形成免疫屏障[23]。IL-1β参与体液免疫和细胞免疫,可以促进血管内皮-白细胞黏附分子的表达,趋化中性粒细胞等炎性细胞进入肠道病变部位,增加肠黏膜的通透性,破坏肠屏障,从而引起一系列肠道炎症反应和组织破坏[24-25]。本实验中,经过小肠干扰术造模后,大鼠血清sIgA水平明显降低,血清IL-1β水平明显升高;肠黏膜下充血水肿,大量炎症细胞浸润;表明大鼠的肠黏膜受到破坏,肠道免疫功能减退,炎症反应被激活。大建中汤组大鼠血清sIgA水平升高,血清IL-1β水平降低,上述病理改变均较轻,表明大建中汤可明显减轻肠道炎症,保护肠黏膜屏障,维持肠道免疫功能。

综上所述,术后肠梗阻的核心病理主要包括胃肠运动功能障碍和肠黏膜屏障破坏,这与胃肠激素分泌失衡、炎症因子诱导趋化、肠道免疫紊乱等关系密切。大建中汤能够有效改善术后肠梗阻大鼠的胃肠功能,分析与其能降低血清VIP水平促进胃肠运动,升高sIgA水平、下调IL-1β水平从而调控肠道炎症反应,保护肠黏膜屏障,维持肠道免疫功能有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。