白芍总苷对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜的保护作用及机制

李学永,康维娜,温进平,路新卿

(邯郸市第一医院,河北 邯郸 056000)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是临床上较为常见的一种消化系统疾病,患者临床主要表现为食欲不振、恶心、嗳气、上腹部疼痛等,病理学变化主要为胃黏膜变薄、炎性细胞浸润、腺体减少与萎缩、肠上皮化生等,属于胃癌癌前病变阶段[1-2]。CAG病理机制非常复杂,炎症与细胞凋亡在其进展过程中具有重要作用[3-4]。中医将CAG归属于“胃脘痛”“胃痞”“反酸”“呃逆”等范畴,脾胃虚弱、肝郁气滞、痰湿内阻是其主要病机[5]。中药白芍(又名青羊参)为毛茛科植物芍药的干燥根,性微寒,味微苦、酸,入肝、脾经,具有益肝健脾、养血调经、祛风除湿等功效,《云南中草药》记载“治食积、胃痛、腹胀满”。白芍总苷为中药白芍的主要活性成分,由芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷等成分组成,具有较好的抗炎活性和调控细胞凋亡作用[6-7]。目前,临床上白芍总苷主要用于类风湿关节炎的治疗,作用机制与调控Janus激酶2(JAK2)/信号转导与转录激活子3(STAT3)信号通路而抑制炎症反应有关[8]。本研究通过复制CAG大鼠模型,基于JAK2/STAT3通路探讨了白芍总苷对CAG大鼠胃黏膜的保护作用及其机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 147只SPF级7周龄SD大鼠,体重(210±20)g,购于玛斯生物技术(固安)有限公司[SCXK(冀)2021-004]。大鼠分笼饲养于邯郸康业制药有限公司[SYXK(冀)2019-003],控制饲养室温度(24±1)℃、湿度(60±5)%、光暗12 h∶12 h循环。本实验通过邯郸市第一医院伦理委员会批准[HDDYLL(K) 2021-007]。

1.2药物与试剂 白芍总苷胶囊购自宁波立华制药有限公司(规格:0.3 g/粒,批号:210319);维酶素片购自四川大冢制药有限公司(规格:0.2 g/片,批号:2021051708);N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)购自日本东京化成工业株式会社(批号:75F71-TF);雷尼替丁胶囊购自宜昌人福药业有限责任公司(规格:0.15 g/粒,批号:D21B314);胃泌素、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)ELISA定量分析试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司(批号:SEKH-0418、SEKR-0009、SEKR-0005、SEKR-0014);胃动素ELISA定量分析试剂盒和HE、TUNEL染色试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号:H182、D006-1-3、G001-2-1);JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗体购自英国Abcam公司(批号:ab32076、ab32162、ab50247、ab50289);核因子-κB(NF-κB)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Cleved Caspase-3抗体购自美国Affinity公司(批号:AF6392、AF6012、AF5663、AF3245);ECL化学发光试剂盒、内参β-actin抗体购自北京博奥森生物技术有限公司(批号:C05-07004、bs-0061R)。

1.3主要仪器 HM355S型石蜡切片机(上海聚慕医疗器械有限公司);BX51型显微镜(日本Nikon公司);MK3型酶标仪(芬兰雷勃有限公司);10148型低温离心机(美国 Sigma公司);24DH型电泳仪、31C型转膜槽(北京六一生物科技有限公司)。

1.4实验方法 大鼠适应性饲养7 d后,随机取24只大鼠作为正常组,其余大鼠参照白雪峰等[9]报道的方法构建CAG模型:0.04 g/mL MNNG水溶液自由饮用+0.03 g/kg雷尼替丁灌胃(1次/d)+饥饱失常饮食(饱食2 d、禁食1 d),连续20周。随机取3只大鼠,以病理学观察胃黏膜腺体数量减少、炎性细胞浸润即为造模成功[10-11]。将剩余120只CAG模型大鼠随机分为模型组、维酶素组和白芍总苷低、中、高剂量组,每组24只。白芍总苷低、中、高剂量组分别灌胃75 mg/kg、150 mg/kg、300 mg/kg白芍总苷(根据人与大鼠剂量换算公式计算所得,低、中、高剂量相当于人临床剂量的1/2倍、1倍、2倍),维酶素组灌胃250 mg/kg维酶素(根据人与大鼠剂量换算公式计算所得),正常组和模型组灌胃等体积生理盐水,均1次/d,连续12周。

1.5检测指标及方法

1.5.1胃黏膜血流量 末次灌胃后,每组随机取12只大鼠,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,参照刘远婷等[12]报道的中性红清除法测定每只大鼠胃黏膜血流量。

1.5.2血清胃泌素和血浆胃动素含量 取各组剩余的12只大鼠,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,经腹主动脉取血,4 ℃静置30 min后2 500 r/min(离心半径为10 cm)离心5 min,取上清液即血清;通过抗凝采血管经腹主动脉取血,4 ℃下2 500 r/min(离心半径为10 cm)离心5 min,取上清液即血浆;分别按照ELISA试剂盒操作说明检测血清胃泌素和血浆胃动素含量。

1.5.3胃黏膜病理学形态和细胞凋亡情况 颈椎脱臼处死大鼠后取胃组织,沿胃大弯剪开,部分胃黏膜经10%中性福尔马林固定72 h后,依次行石蜡包埋、5 μm切片、烤片、脱蜡水化处理后,遵照HE试剂盒操作说明染色后观察胃黏膜病理学形态,遵照TUNEL试剂盒操作说明染色后观察胃黏膜细胞凋亡情况。参照Dixon等[13]报道的标准对胃黏膜萎缩病变进行评分,按无、轻、中、重4个级别分别计0,2,4,6分。计数凋亡细胞数,计算凋亡指数(凋亡细胞数占总细胞数的百分比)。

1.5.4胃黏膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8含量取部分胃黏膜组织,剪碎后加入4 ℃ PBS缓冲液,冰上研磨匀浆,4 ℃下3 500 r/min(离心半径为10 cm)离心10 min取上清液,然后分别按照ELISA试剂盒操作说明检测胃黏膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8含量。

1.5.5胃黏膜组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、NF-κB、Bcl-2、Bax、Cleved Caspase-3蛋白表达情况 采用 Western blot法检测:取每只大鼠100 mg胃黏膜组织,加入1 mL蛋白裂解液后冰上研磨匀浆,冰上静置30 min后4 ℃、12 000 r/min(离心半径为10 cm)离心30 min取上清液,BCA法蛋白定量后,各组分别以30 μg总蛋白量上样,10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后转至PVDF膜,5%蛋白封闭液室温封闭1 h,一抗稀释液JAK2(1∶800)、p-JAK2(1∶800)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Cleved Caspase-3(1∶1 000)、内参β-actin(1∶1 500)4 ℃孵育12 h,洗膜后二抗稀释液(1∶3 000)室温孵育1.5 h,洗膜后ECL显色,通过Image J软件检测蛋白条带灰度值。

2 结 果

2.1各组大鼠胃黏膜血流量及血清胃泌素和血浆胃动素含量比较 模型组大鼠胃黏膜血流量及血清胃泌素、血浆胃动素含量均明显低于正常组(P均<0.05);白芍总苷各组和维酶素组大鼠胃黏膜血流量及血清胃泌素、血浆胃动素含量均明显高于模型组(P均<0.05),且白芍总苷低、中、高剂量组各指标呈剂量依赖性升高(P均<0.05);白芍总苷低、中剂量组大鼠胃黏膜血流量和白芍总苷低剂量组大鼠血清胃泌素、血浆胃动素含量均明显低于维酶素组(P均<0.05);白芍总苷高剂量组大鼠血清胃泌素、血浆胃动素含量均明显高于维酶素组(P均<0.05),胃黏膜血流量与维酶素组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 正常组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜血流量和血清胃泌素、血浆胃动素含量比较

2.2各组大鼠胃黏膜病理学表现和细胞凋亡情况正常组大鼠胃黏膜腺体排列规律、紧密,仅可见极少量凋亡细胞;与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜变薄,可见腺体减少、萎缩、排列紊乱,大量炎性细胞浸润,胃黏膜细胞凋亡数量明显增多,萎缩评分和凋亡指数明显升高(P均<0.05);与模型组比较,白芍总苷各组和维酶素组大鼠胃黏膜病理学变化和细胞凋亡状况不同程度改善,白芍总苷低、中、高剂量组大鼠萎缩评分和凋亡指数均呈剂量依赖性降低(P均<0.05);白芍总苷低、中剂量组大鼠萎缩评分和凋亡指数均明显高于维酶素组(P均<0.05);白芍总苷高剂量组大鼠凋亡指数明显低于维酶素组(P<0.05),萎缩评分与维酶素组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、图2及表2。

图1 正常组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜病理学形态(HE染色,×400)

图2 正常组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜细胞凋亡情况(TUNEL染色,×400)

表2 正常组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜萎缩评分和细胞凋亡指数比较

2.3各组大鼠胃黏膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8含量比较 模型组大鼠TNF-α、IL-6、IL-8含量均明显高于正常组(P均<0.05)。白芍总苷各组和维酶素组大鼠TNF-α、IL-6、IL-8含量均明显低于模型组(P均<0.05),且白芍总苷低、中、高剂量组各指标呈剂量依赖性降低(P均<0.05);白芍总苷低剂量组大鼠TNF-α、IL-6、IL-8含量均明显高于维酶素组(P均<0.05);白芍总苷中剂量组大鼠TNF-α、IL-8含量和白芍总苷高剂量组大鼠TNF-α、IL-6、IL-8含量均明显低于维酶素组(P均<0.05)。见表3。

表3 正常组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜组织红TNF-α、IL-6、IL-8含量比较

2.4各组大鼠胃黏膜组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达情况比较 模型组大鼠p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量及JAK2、STAT3磷酸化率(p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3)均明显高于正常组(P均<0.05);白芍总苷各组和维酶素组大鼠p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3均明显低于模型组(P均<0.05),且白芍总苷低、中、高剂量组各指标呈剂量依赖性降低(P均<0.05);白芍总苷低、中剂量组大鼠p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3均明显高于维酶素组(P均<0.05);白芍总苷高剂量组大鼠p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3均明显低于维酶素组(P均<0.05)。见图3及表4。

图3 正常组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表达情况

表4 正常组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比较

2.5各组大鼠胃黏膜组织中NF-κB、Bcl-2、Bax、Cleved Caspase-3蛋白表达情况比较 与正常组比较,模型组大鼠NF-κB、Bax、Cleved Caspase-3蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量明显降低(P<0.05);与模型组比较,白芍总苷低、中、高剂量组大鼠NF-κB、Cleved Caspase-3蛋白相对表达量和白芍总苷中、高剂量组大鼠Bax蛋白相对表达量呈剂量依赖性降低(P均<0.05),白芍总苷低、中、高剂量组大鼠Bcl-2相对表达量呈剂量依赖性升高(P均<0.05)。白芍总苷低剂量组大鼠NF-κB、Bax、Cleved Caspase-3蛋白相对表达量和白芍总苷中剂量组Bcl-2、Bax蛋白相对表达量均明显高于维酶素组(P均<0.05),白芍总苷低剂量组大鼠Bcl-2蛋白相对表达量和白芍总苷中剂量组Cleved Caspase-3蛋白相对表达量均明显低于维酶素组(P均<0.05);白芍总苷高剂量组大鼠NF-κB、Bax、Cleved Caspase-3蛋白相对表达量均明显低于维酶素组(P均<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量明显高于维酶素组(P<0.05)。见图4及表5。

图4 正常组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜组织中NF-κB、Bcl-2、Bax、Cleved Caspase-3表达情况

表5 正常组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜组织中NF-κB、Bcl-2、Bax、Cleved Caspase-3蛋白相对表达量比较

3 讨 论

CAG主要病理表现为胃黏膜固有腺体的减少, 胃黏膜血流量和血清胃泌素、血浆胃动素含量降低[14]。维酶素主要成分为核黄素及其衍生物,是临床治疗CAG的一线用药,常作为阳性对照药物用于CAG实验研究[15]。本实验研究结果显示,CAG模型大鼠胃黏膜血流量和血清胃泌素、血浆胃动素含量均显著降低,胃黏膜呈现腺体减少、萎缩、排列紊乱、大量炎性细胞浸润等病理学变化;白芍总苷各组大鼠胃黏膜血流量和血清胃泌素、血浆胃动素含量明显升高,胃黏膜病变减轻,萎缩评分明显降低,且白芍总苷高剂量组血清胃泌素、血浆胃动素含量明显高于维霉素组。说明白芍总苷能够改善CAG大鼠黏膜血流量,提高胃动力,减轻胃黏膜损伤,且高剂量白芍总苷的作用优于维酶素。

炎症反应和细胞凋亡是CAG胃黏膜损伤及进行性加重的关键因素。炎症因子IL-6能够诱导中性粒细胞和单核细胞在炎症部位聚集,TNF-α则能够刺激中性粒细胞等进一步释放炎症因子而加重炎症损伤[16-17]。胡掌朝等[18]报道血清IL-8、TNF-α水平与CAG病变程度呈显著正相关。凋亡是细胞程序化自主死亡的一种方式,多种蛋白参与其过程调控。Bax位于线粒体膜,能够调控线粒体膜孔道异常开放,导致细胞色素C等释放进入细胞质,细胞色素C可剪切活化Caspase-3,Cleaved Caspase-3则剪切破坏膜蛋白、结构蛋白等分子结构而引发细胞凋亡[19]。同样定位于线粒体膜的Bcl-2可抑制线粒体膜孔道异常开放和细胞色素C释放,抑制凋亡。JAK2属于酪氨酸蛋白激酶,能够被IL-6、IL-8等细胞因子作用于跨膜受体而诱导JAK2 磷酸化,p-JAK2能够诱导STAT3磷酸化[20]。NF-κB核转位后能够促使TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子表达,p-STAT3能够诱导NF-κB表达与核转位而间接促进炎症反应[21]。高伟静等[22]报道p-STAT3能够促进Bax表达并抑制Bcl-2表达而促进细胞凋亡。本研究发现,白芍总苷能够剂量依赖性降低CAG大鼠胃黏膜细胞凋亡指数和组织中TNF-α、IL-6、IL-8含量,可降低胃黏膜组织中p-JAK2、p-STAT3、NF-κB、Bax、Cleved Caspase-3蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3,提高胃黏膜组织中Bcl-2蛋白相对表达量,并且白芍总苷高剂量组上述效应优于维霉素组。说明白芍总苷能够减轻CAG大鼠胃组织炎症损伤,抑制胃黏膜细胞凋亡,机制可能与抑制JAK2/STAT3通路活化有关。

综上所述,白芍总苷能够明显提高CAG大鼠胃黏膜血流量和胃动力,减轻胃黏膜病变,作用机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路活化,从而减轻炎症损伤和抑制细胞凋亡有关。本研究结果为白芍总苷作为CAG治疗备选药物提供了一定理论依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。