应用数字病理技术对脑脊液检验三种方法收集细胞效率及形态学比较研究

刘婷婷，杜 芳，贺 莹，边 婷，周慧敏，易招师，李晓娜，李 雯

（1.空军军医大学第一附属医院神经内科，西安 710032；2.江西省儿童医院神经内科，江西南昌 330006）

脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）细胞学对中枢神经系统疾病的诊断和治疗具有重要意义，尤其对中枢血液系统恶性肿瘤的诊断提供关键参考依据，其中最常见的就是中枢神经系统淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）和中枢神经系统白血病（central nervous system leukemia，CNSL）。CSF 细胞学辅助PCNSL 的诊断具有创伤少、患者容易接受的优势。随着诊疗技术的发展，近年来出现了许多新方法帮助诊断CNSL，但细胞学仍是CNSL 诊断的金标准[1-3]，早期明确诊断并给予针对性治疗是患者提高生存率的关键[4]。而CSF 细胞收集技术是细胞学的核心，由于CSF 中细胞密度较低，且收集过程中各种因素不可避免的造成细胞溶解或皱缩，严重影响检出率，因此，提高收集效率是CSF 细胞学检查的关键。

本研究选取了三种细胞学收集方法：自然沉淀法、赛默飞Cytospin-4 及粟氏FMMU-6 的离心沉淀法，每份样本均用这三种方法进行细胞收集，制片染色后对玻片进行扫描成像，应用HALO 软件进行定量分析，比较三种方法在不同细胞计数区间的收集率。同时通过专业人员验证三种方法对血液系统恶性肿瘤患者CSF 中病理性细胞的检出率，以期给临床医师提供更多的参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 募集2020 年7～10 月在西京医院细胞学研究室送检的CSF 标本共计122 例。其中，CSF 白细胞计数（white blood cell，WBC）正常的白血病/淋巴瘤确诊患者36 例，包括急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）9 例，急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）14 例，淋巴瘤13 例。最终检出累及中枢神经系统的患者5 例（ALL 2 例，AML1 例，淋巴瘤2 例），白血病/淋巴瘤及中枢浸润的诊断依据中华医学会诊疗指南及中国临床肿瘤学会诊疗指南[5-7]。本研究已通过第四军医大学第一附属医院伦理委员会批准（批号KY20151103-2 号）。所有CSF 均在抽取2h 内送检[8]。因WBC ≥500×106/L 时，玻片上收集的细胞易重叠影响统计[9]，故本实验选取入组的标本WBC＜500×106/L。

1.2 仪器与试剂 Cytospin-4 型细胞离心沉淀仪（赛默飞Shandon 公司），FMMU-6 型细胞离心沉淀仪（湖南赛特湘仪），BX53 显微镜（OLYMPUS），PANNORAMIC 型全景切片扫描仪（3DHISTECH）及HALO v3.0.311.314 分析软件。瑞氏-姬姆萨染色液（May-Grüwald-Giemsa，MGG）[10]，WBC 计数板。

1.3 方法

1.3.1 三种方法CSF 细胞收集率比较：实验分组：根据CSF 细胞数分为四组：WBC ≤10×106/L，11×106/L ≤WBC ≤50×106/L，51×106/L ≤WBC ≤100×106/L，101×106/L ≤WBC ≤500×106/L。

实验条件：细胞收集时的加样量取决于CSF 细胞计数，同一标本进行三种方法收集时的加样量和离心时间一致。当WBC ≤10×106/L，及11×106/L≤WBC ≤50×106/L 时加样量为500μl，离心时间5min，当51×106/L ≤WBC ≤100×106/L 时加样量为400μl，离心时间4min，当101×106/L≤WBC ≤500×106/L 时加样量为300μl，离心时间3min。本实验除自然沉淀法不需离心外，其它两种方法的离心力均控制在70g。

细胞收集及染色：①自然沉淀法：向粟氏沉淀器小室中加入CSF，至水分被滤纸吸干。②Cytospin-4 离心沉淀法：遵循Cytospin-4 型沉淀仪操作标准进行操作[10]。③FMMU-6 离心沉淀法：沉淀器中加入CSF，低速离心，至标本完全干燥[9]。CSF 细胞收集完成后进行MGG 染色[11]。

数字病理图像分析：运用PANNORAMIC全景式切片扫描仪对染色后的玻片进行扫描成像，Case Viewer2.4 软件读取数据。使用HALO v3.0.311.314分析软件中Indica Labs-Multiplex IHC v2.2.0 模块定量每张玻片目的区域中核染色呈深紫色的细胞个数。红细胞、溶解细胞及其它异物被识别为杂质。

细胞收集率计算：经玻片扫描分析后可获得每张玻片收集到细胞总数为a，三种方法中每个标本加样体积（v）及单位体积细胞计数n 明确，计算得到每个标本实际加样细胞总数A=v×n，细胞收集率（rate，R）可计算为：R=a/A×100%。

1.3.2 比较三种收集方法对WBC 正常白血病/淋巴瘤患者CSF 中病理性细胞的检出率：对36 例WBC 正常白血病/淋巴瘤患者的CSF 玻片进行镜检。由三位专业技术人员在未知患者诊断的情况下，分别对三种方法制备的玻片进行CSF 病理性细胞的查找。

1.4 统计学分析 使用SPSS21.0 软件进行统计学分析，计量资料不符合正态分布，采用两样本间的非参数检验，以中位数(四分位数)［M(Q1，Q3)］表示，组间差异采用Kruskal-Wallis 秩和检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三种方法CSF 细胞收集率比较 见表1，图1。FMMU-6 与Cytospin-4 分别与自然沉淀法进行收集率的比较，差异具有统计学意义（均P＜0.01）；当WBC ≤10×106/L，11×106/L ≤WBC ≤50×106/L 及51×106/L ≤WBC ≤100×106/L 时进行比较，FMMU-6 的收集率均高于Cytospin-4 离心沉淀法，差异具有统计学意义（z=8.07，2.51，2.61；P＜0.001，0.05，0.01）；但当101×106/L ≤WBC≤500×106/L 时FMMU-6 与Cytospin-4 离心沉淀法进行比较差异无统计学意义（z=1.40，P=0.91）。

图1 不同分组CSF 细胞收集方法收集率比较

表1 不同WBC 分组CSF 细胞收集方法收集率比较[M(Q1，Q3)，%]

2.2 三种收集方法对CSF 细胞形态学影响 见图2，表2。对三种收集方法制备好的玻片进行镜检，可以观察到Cytospin-4 和FMMU-6 收集到的细胞完整度均较好，而自然沉淀法更易出现细胞皱缩的情况，不利于细胞形态的辨认。

图2 三种CSF 细胞收集法制片图

表2 5 例WBC 正常CNSL/淋巴瘤患者CSF 检查结果

对36 例确诊白血病/淋巴瘤患者CSF 玻片进行显微镜观片，查找CSF 病理性细胞，共检出阳性5 例（ALL2 例，AML1 例，淋巴瘤2 例），其中FMMU-6 的玻片检出5 例（13.9%），Cytospin-4 的玻片检出3 例（8.3%），自然沉淀法的玻片检出1例（2.8%）。

3 讨论

CSF 细胞学在中枢神经系统疾病的诊断中发挥重要作用，尤其为中枢血液系统恶性肿瘤的诊断提供重要依据。而细胞收集效率是CSF 细胞学检查的关键。本研究采用数字病理技术统计全片细胞数，对目前临床使用的三种CSF 细胞收集方法进行 比较。

数字病理扫描和分析技术的使用已越来越广泛[12-14]，其中HALO 是美国Indica Labs 推出的基于人工智能的数字病理图像分析平台[15]。HALO 主要基于先进的神经网络算法，可对多种病理扫描切片进行定量研究。在切片扫描仪进行全切片扫描成像后，HALO 可通过对成像数据中的细胞进行分析，报告细胞的形态学特征及表达数据，根据标记强度对细胞进行排序，可视化的识别相应的细胞。HALO 分析软件中的Indica Labs - Multiplex IHC v2.2.0模块可定量每张切片目的区域的目标细胞数。目前，HALO AI 已应用于生物学、神经科学、肿瘤学等多个领域。其参数设置和操作较为简单，为缺乏图像分析经验的研究人员提供了方便。HALO 的多核并行处理技术也使其分析效率变的十分高效。

本实验基于数字病理扫描分析技术比较三种CSF 细胞学收集方法，结果显示：Cytospin-4和FMMU-6 的离心沉淀法收集率均优于自然沉淀法；两种离心沉淀法中FMMU-6 具有更好的收集效率，当WBC＜10×106/L 时FMMU-6 的优越性更佳，一般情况下，很多中枢神经系统感染性疾病的患者CSF 细胞计数常会高于10×106/L，但计数＜10×106/L 的患者并不代表细胞学完全正常，一些肿瘤，CNSL 和PCNSL 患者，计数可能出现＜10×106/L，甚至WBC＜1×106/L；肿瘤细胞蛋白质、核酸合成异常旺盛，胞内内容物多，质量大，理论上在离心力或渗透压改变时比正常细胞更易失去完整形态，此时能收集到形态完整足够用于分析的细胞数量对临床诊断尤为重要。另外，实验通过对WBC 正常的确诊血液系统肿瘤患者CSF 细胞进行收集、染色及专业人员镜检，查找CSF 病理性细胞，结果显示Cytospin-4 和FMMU-6 的离心沉淀法收集到的细胞形态较自然沉淀法更好，其中，FMMU-6 检出阳性例数最多。本实验为目前唯一通过扫描分析技术提供具体CSF 细胞收集率的比较研究，以期为临床提供理论参考依据。

CSF 细胞学技术在过去的100 年有了长足的发展，自1954 年Saky 运用细胞沉淀室和带孔吸水滤纸发明了细胞沉淀器，推动了该领域的发展。1966年WATSON 等将细胞玻片离心法引入到CSF 的收集中。1979 年侯熙德研制出侯氏细胞离心沉淀仪，首次将Saky 细胞沉淀室与离心沉淀原理相结合。随后1981 年粟秀初在现有基础上继续改进，研制出粟氏离心沉淀仪。至此，细胞学收集技术一直在不断得到改良[10-11]。近年来随着检测技术的发展，流式细胞术（flow cytometry，FCM）开始成为诊断血液系统疾病不可缺少的技术手段，相比CSF 细胞学，它的阳性率更高，但因其对标本质量和技术要求较高，也存在一定的假阳性率，FCM 仍无法完全取代细胞学[2,16]。目前临床上推荐采用CSF 细胞学联合FCM来辅助诊断累及中枢的血液系统肿瘤。

三种CSF 收集方法各有优缺点：常用的自然沉淀法操作简单，主要原理是使细胞自然沉淀到载玻片上，通常可借助沉淀小室和滤纸完成细胞沉降，优点是细胞不受外力影响，损伤较小，缺点是因作用时间较长，细胞可能出现皱缩现象，影响细胞形态；而离心沉淀同时借助低速离心力及改良的细胞沉淀室让CSF 中的水分在短时间内与有形成分分离。如基于FMMU-6 及Cytospin-4 的离心沉淀法。利用低速离心减弱了离心力对细胞的破坏作用，加快了制片时间，改进了自然沉淀由于时间长而造成的细胞皱缩问题，同时配合改良的细胞沉淀室更好地集中标本提高收集率。其中，FMMU-6 的沉淀室继续沿用Saky 细胞沉淀室压力可调的原理并使用带有螺纹的轻型沉淀管，从而可根据标本的细胞密度差异对玻片的受力进行调整，以减少细胞流失[9-11]，增加了细胞收集率的同时细胞的完整性也更好，缺点则是技术人员需要经过培训才能熟练掌握。而Cytospin-4 沉淀室则采用金属玻片夹和压力板固定沉淀室，也达到了良好的收集效果[10]，能较好地满足临床需求，且实验人员无需培训可直接操作，使用较为便捷，缺点则是玻片夹不可调节，灵活性稍差，细胞极少、或蛋白高等特殊标本收集效果可能会受到影响。

本试验仍有不足之处，除了上述三种CSF 细胞收集方法外，未验证的还有细胞离心涂片法、侯氏细胞沉淀法、孔式细胞沉淀法、微孔薄膜收集法以及液基薄层制片法等，鉴于客观条件及患者标本量的限制，没有纳入研究。本研究选取的三种方法中，基于沉淀室的自然沉淀法无需离心，细胞不受外力作用，理论上可能更利于收集血液系统恶性肿瘤细胞[17]，故进行进一步验证。其余两种方法则为临床广泛使用的离心沉淀法[10]，Cytospin-4 目前已得到国外学者的普遍认可，收集效果良好；近年来，国内学者们对脑脊液细胞收集方法的改进原理均基于低速离心力与改良的沉淀室相结合，鉴于实验条件，本研究选取其中的FMMU-6 离心沉淀法作为参考，希望为未来国内细胞学收集方法的进一步改进提供理论依据。

综上所述，基于数字病理技术统计细胞密度，大大提高了试验的精确性，为后续相关研究提供了可供参考的数据。本研究选取的三种收集方法各有其优劣，临床工作者可根据实际情况和检验需求进行选择，以便在有限条件下获得数量和形态均良好的制片效果，从而更好地为临床诊断服务。