慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者血清miR-221-3p和miR-149-3p表达水平及其与预后的相关性分析

郭大伟，李 维，赵雪林（.江油市人民医院，四川绵阳 6700；.广元市精神卫生中心，四川广元 68000）

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种进行性气流受限的慢性炎症疾病，容易出现缺血性心脏病、心房颤动、心力衰竭、呼吸衰竭、骨质疏松症、焦虑、抑郁等多种并发症，严重危害人们的健康生活[1-2]。研究发现，慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者呼吸困难增加、运动能力下降、体力活动和生活质量下降，预后较差，严重时会造成死亡[3]。因此，寻找与慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后有关的生物标志物有助于临床上对患者进行有效治疗，挽救患者生命。微小核糖核酸（micro RNA，miR）在转录后水平能够调节基因表达，在发育、代谢、细胞分化、增殖、迁移、信息传导、细胞死亡和应激反应等生理和病理过程中发挥关键作用[4]。miR-221-3p 是两种最易失调的miRs 之一，影响血管平滑肌细胞、软骨细胞的增殖和迁移，引发炎症反应和动脉的血管表型转换，造成血管功能障碍，在肿瘤和心血管疾病中具有重要作用[5-6]。miR-149-3p 是一种炎症相关分子，通过调节受体信号通路介导细胞间通讯，影响细胞的增殖和分化[7-8]。但在慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭方面没有明确的研究，因此，本研究通过检测慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者血清中miR-221-3p 和miR-149-3p 的表达水平，分析其与患者预后的相关性，以期为临床慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后进行评估。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019 年4 月～2021 年10 月在江油市人民医院治疗的180 例慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者，其中男性92例，女性88例，平均年龄67.55±6.95 岁。对患者进行一年的随访，将患者分为生存组（n=120）和死亡组（n=60）。其中生存组男性60 例，女性60 例，平均年龄67.45±6.85 岁，体质量指数22.68±1.34kg/m2；吸烟史36 例，APACHE Ⅱ评分12.80±4.45 分；死亡组男性32 例，女性28 例，平均年龄67.75±7.15岁，体质量指数23.01±1.42kg/m2；吸烟史28 例，APACHE Ⅱ评分27.45±6.05 分。死亡组性别、年龄、体质量指数与生存组具有可比性（χ2=0.178，t=0.273，1.527，均P＞0.05），在吸烟、APACHEⅡ评分上具有明显差异（χ2=4.849，t=18.395，P＜0.05）。纳入标准：①患者确诊，符合慢性阻塞性肺疾病诊断标准[9]；②并发Ⅱ型呼吸衰竭，符合呼吸衰竭诊断标准[10]；③有咳嗽、气急等症状；④年龄＞18 周岁，且自愿签署同意书。排除标准：①肺部阴影，有哮喘病史；②肝肾功能衰竭者；③并发冠心病、心肌病、心肌梗死等疾病；④临床资料不全。本研究以人为本、尊重患者、恪守医德、严谨求实，经医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 Trizol 试剂盒（货号：SH-2366，北京凯诗源生物科技有限公司）；M-MLV反转录试剂盒（货号：PR2555，北京普非生物科技有限公司）；miR-221-3p，miR-149-3p 引物及U6 内参引物（广州锐博生物公司）；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪（型号：Mastercycler ep realplex，德国Eppendorf 公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本收集：收集所有患者入院后24h 内空腹静脉血3～4ml，自然冷却至室温后进行血清分离，于-86℃冰箱中保存以备检测。

1.3.2 qRT-PCR 法检测血清miR-221-3p，miR-149-3p 的表达水平：根据Trizol 试剂盒说明书对各组样品中总RNA 进行提取，并对总RNA 浓度和纯度进行评估。按照M-MLV 反转录试剂盒说明进行反转录[反转录体系：总RNA（2 μl），RNase Free dH2O（20 μl），PrimeScript RT Master Mix（4 μl）]，以cDNA 为模板，采用qRT-PCR 检测样本中miR-221-3p，miR-149-3p 的表达水平（PCR体系：cDNA 模板0.5 μl，ddH2O 5 μl，正向引物0.5 μl，反向引物0.5 μl，2×Taq PCR master mix 6.5μl），条件：预变性：95℃，15 min，（变性：95℃，15s；退火延伸：65℃，45s）40 个循环。miR-221-3p，miR-149-3p 引物及U6 内参引物序列见表1。每组实验重复三次，获取miRNAs 的Ct值，以生存组miR-221-3p，miR-149-3p 水平为基准使用2-ΔΔCt方法对其相对表达水平进行分析。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.4 统计学分析 SPSS 25.0 进行数据处理，计量资料均符合正态分布，采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验进行比较；Spearman 法分析miR-221-3p，miR-149-3p 与APACHE Ⅱ评分的相关性。对影响慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后的因素以逐步向前法进行Logistic 回归分析；受试者工作特征（ROC）曲线分析miR-221-3p 和miR-149-3p 的表达对慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后的预测价值，曲线下面积（AUC）比较采用Z 检验；P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血清miR-221-3p，miR-149-3p 的表达水平比较 与生存组相比，死亡组慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者血清miR-221-3p 表达水平明显升高（1.54±0.36 vs 1.02±0.18），miR-149-3p表达水平显著降低（0.66±0.16 vs 1.01±0.21），差异均有统计学意义（t=12.938,11.360,均P＜0.01）。

2.2 患者血清miR-221-3p，miR-149-3p 水平与APACHE Ⅱ评分的相关性 慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者血清miR-221-3p 水平与APACHE Ⅱ评分呈正相关（r=0.509，P＜0.05），miR-149-3p 水平与APACHE Ⅱ评分呈负相关（r=-0.470，P＜0.05）。

2.3 Logistic 回归分析慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后的影响因素 见表2。以慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后为因变量，吸烟、APACHE Ⅱ评分、miR-221-3p，miR-149-3p 为自变量进行Logistic 回归分析，结果发现，吸烟、APACHE Ⅱ评分、miR-221-3p 是影响慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后的危险因素（P＜0.05），miR-149-3p 是影响患者预后的保护因素（P＜0.01）。

表2 Logistic 回归分析慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后的影响因素

2.4 血清miR-221-3p，miR-149-3p 水平对慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后的预测价值见表3 和图1。ROC 曲线显示，血清miR-221-3p，miR-149-3p 和二者联合预测慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后的AUC 分别为0.889，0.860和0.959，二者联合检测优于其各自单独预测（Z=2.174，3.225，P=0.015，＜0.01）。

图1 miR-221-3p，miR-149-3p 水平预测慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后的ROC 曲线

表3 血清miR-221-3p，miR-149-3p 水平对慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后的预测价值

3 讨论

慢性阻塞性肺疾病以肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和细胞毒性T 淋巴细胞的数量增加，以及脂质、趋化因子、细胞因子、生长因子等多种炎症介质释放为特征，导致小气道固定狭窄和肺泡壁破坏，严重时会造成残疾和死亡[11]。研究发现，慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭与增加的通气负荷有关，动态过度膨胀导致失去弹性后坐力以及横膈膜和胸腔的几何变化，进而损害了膈肌、肋间肌和副肌的功能[12]，一些生物标志物如白介素-17[13]、补体1q/肿瘤坏死因子相关蛋白5[14]，B 型脑利钠肽[15]等用于评估慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后出现的气流受限、炎症损伤、肺毛细血管网受损等危险，以便为患者给予及时的治疗。因此，寻找与慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后相关的因子，有助于临床医疗中对患者进行及时的治疗，改善患者预后。

miRs 在血清、血浆和脑脊液中以稳定且无细胞的形式进行循环，能够降解mRNA、抑制翻译，导致蛋白质合成终止，在急性心肌梗死，心力衰竭、糖尿病、中风、急性肺栓塞、神经退行性疾病等疾病中参与细胞分化、增殖和凋亡[16]。miR-221-3p 与内皮炎症、冠状动脉损伤、血管内皮损伤有关，在慢性阻塞性肺疾病具有重要作用[17]。研究发现，miR-221-3p 与心肌肌钙蛋白呈正相关，与心肌损伤严重程度有关，影响慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者的预后[18]。SHEN 等[19]研究发现，慢性阻塞性肺病患者血清miR-221-3p 水平高于健康志愿者，可以激活MAPK 信号和NF-κB 信号，加重炎症，能够对慢性阻塞性肺疾病的炎症功能进行评估。ZHANG 等[20]研究发现，患者肺组织中miR-149-3p 水平低于对照组，影响Wnt 通路的信号传递，导致肺泡炎性因子的表达发生变化，从而影响慢性阻塞性肺疾病的发展。LEI 等[21]研究发现，慢性阻塞性肺疾病患者血清miR-149-3p 表达下调，通过调节NF-κB 信号通路，促进人支气管上皮细胞增殖并抑制凋亡。本研究通过对180 例慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者血清miR-221-3p和miR-149-3p 的水平进行测定发现，与生存组相比，死亡组慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者血清miR-221-3p 水平、APACHE Ⅱ评分均明显升高，miR-149-3p 水平显著降低。说明miR-221-3p，miR-149-3p 与慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后具有一定的关系。APACHE Ⅱ评分常用于慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后的监测[22]。进一步研究发现，患者血清miR-221-3p 水平与APACHE Ⅱ评分呈正相关，miR-149-3p 水平与APACHE Ⅱ评分呈负相关。进一步说明miR-221-3p，miR-149-3p 水平与慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后关系密切。miR-221-3p和miR-149-3p 可作为对慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后情况判断的指标，对其水平进行检测可协助判断患者预后情况。研究发现，miR-221-3p 和miR-149-3p 均与炎性细胞因子水平相关，对患者上气道的狭窄和阻塞以及慢性阻塞性肺疾病具有一定的预测价值[8,19]。经ROC 曲线分析，血清miR-221-3p 和miR-149-3p 联合预测慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后的AUC 为0.959，均优于其各自单独预测，可对患者预后进行较好的评估。miR-221-3p 和miR-149-3p 联合可更有效地预测慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者的预后，推测高水平miR-221-3p，低水平miR-149-3p可能通过调节信号传导，调控炎症水平，从而影响患者的预后。当患者血清中miR-221-3p＞1.24，miR-149-3p＜0.83 时，应在临床上快速制定诊疗方案，及时干预，防止患者病情进一步恶化，危害患者的生命健康。

综上，慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者血清miR-221-3p 水平升高，miR-149-3p 水平降低与患者预后有关，能够对慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后进行预测。然而仍需大量样本对miR-221-3p，miR-149-3p 与慢性阻塞性肺疾病并发Ⅱ型呼吸衰竭患者预后的关系进行进一步验证。同时，血清miR-221-3p 与miR-149-3p 检测采用的是分子生物学的方法，其对实验室要求较高，不宜推广，后续将对其方法改良进行研究。