Sanger测序和AMRS-PCR检测ALDH2基因突变结果的比较*

罗 莎,林昌海,毛雪莹,王贵宇,徐 莉,李 欣,张晓莉△

1.陆军军医大学第一附属医院检验科,重庆 400038;2.重庆大学附属肿瘤医院/重庆市肿瘤研究所/重庆市肿瘤医院,重庆400030;3.重庆大学生命科学学院,重庆 401331

硝酸甘油是治疗心绞痛急性发作的常规首选药物,但该药的临床疗效常因人而异。在中国汉族人群中,含服硝酸甘油无效的比例高达25%以上。有研究证实,使用硝酸甘油效果欠佳的原因与线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)的基因突变有密切关系[1-2]。因此ALDH2基因突变检测对于预测硝酸甘油的疗效有重要作用。目前ALDH2基因突变检测的方法较多,各有其优缺点。扩增阻滞突变系统(ARMS)又称等位基因特异性扩增法,是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。本研究采用ARMS-PCR法以及Sanger测序法分析350例有冠心病、心肌梗死、心绞痛、高血压等临床病史患者的ALDH2基因突变情况的检测结果,通过数据统计分析,比较两种检测方法的差异和临床应用价值,为临床制订用药方案提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 将陆军军医大学第一附属医院2019年10月至2020年1月收治的有冠心病、心肌梗死、心绞痛、高血压等病史的患者共350例纳入研究。其中34例患者有服药史;男207例,女143例;患者年龄最小者23岁,最大者93岁,年龄中位数64岁,将≥65岁的患者作为老年组,<65岁的患者作为非老年组。本研究获医院医学伦理学委员会批准,患者对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 使用的仪器包括ABI7300Plus实时荧光定量PCR仪、ABI3730XL测序仪。血液直接PCR试剂盒/胶回收纯化试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司提供;测序试剂为BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing。人ALDH2基因多态性检测试剂盒(ARMS-PCR法)由上海美吉逾华生物医药科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1检测项目 将上海美吉逾华生物医药科技有限公司生产的人ALDH2基因多态性检测试剂盒(ARMS-PCR法)检测作为评价方法,基因检测国际金标准——Sanger测序法作为参考方法,对纳入研究者的血液标本进行ALDH2基因c.1510多态性位点G>A突变情况检测。

1.3.1制作血卡 血卡标本:向FTA卡上滴加约30 μL抗凝全血,血液完全渗透FTA卡后,60 ℃烘箱干燥10 min或室温自然干燥至少4 h。血卡标本采集时不要堆叠血斑,不与其他界面接触,待血斑充分干燥后应放入无菌袋中,避免标本之间的相互污染。

1.3.2Sanger测序法分析 根据血液直接PCR试剂盒说明书,用血液直接PCR试剂与测序检测引物构建PCR扩增体系。PCR扩增体系为2×Blood Direct PCR Master Mix 12.5 μL,正向引物1 μL,反向引物1 μL,样品模板1～5片直径1 mm的血卡,无RNA酶的ddH2O补齐至25 μL。扩增程序为95 ℃预变性5 min,95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共40个循环,最后72 ℃延伸10 min。目标序列PCR扩增结束后,取PCR产物5 μL,用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,在紫外灯下观察电泳结果并用天根公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带(530 bp)。测序反应体系为测序染料BigDye 0.5 μL,测序反应液Sequencing Buffer 1.75 μL,引物3.2 pmol,模板10 ng,去离子水补齐至10 μL。扩增程序为96 ℃ 2 min,96 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,60 ℃ 90 s,共25个循环;4 ℃保温。用醋酸钠乙醇法进行测序反应产物的纯化,向纯化好的测序反应产物中加入Hi-Di去离子甲酰胺10 μL,然后95 ℃变性4 min,降温至4 ℃后拿出,使用测序仪读取测序数据。用chromas软件打开测序结果文件,分析所测标本的ALDH2基因c.1510位点的基因型。

1.3.3ARMS-PCR法分析 将所取血卡标本或0.5 μL外周血标本加入0.2 mL的离心管中,加入15 μL的A盒预处理液,充分振荡混匀并离心,置于95 ℃金属浴孵育5 min。离心至管盖和侧壁无液体,加入15 μL的A盒稳定液,振荡混匀并离心,完成待测标本制备。扩增体系为B盒ALDH2 1510G反应液22.5 μL,待测标本2.5 μL以及B盒ALDH2 1510A反应液22.5 μL,待测标本2.5 μL,总共2管。PCR扩增程序为为60 ℃ 50 s,95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,共40个循环,并于第4步时同时收集FAM检测信号和VIC内参信号。PCR程序运行结束后,导出实验数据,观察扩增曲线,分析Ct值。为保证检测结果的可靠,设置基线为“AutoBaseline”,FAM和VIC通道阈值为0.03。阴性对照管中各信号的Ct值均应>35或为“Undetermined”,否则此次实验结果无效,重新检测。阳性质控品检测反应体系中,FAM和VIC通道均应形成标准扩增曲线,且Ct值均应≤32,否则此次实验结果无效,重新检测。对于样本检测反应体系,若FAM、VIC通道未形成标准扩增曲线或Ct值>35或“Undetennined”,则该样本检测结果为阴性。FAM、VIC通道形成标准扩增曲线,34

1.4统计学处理 根据记录的检测结果,釆用MedCalc软件计算评价方法与参考方法的野生型符合率、杂合突变型符合率、纯合突变型符合率以及总符合率。釆用SPSS21.0软件对两种方法的检测结果进行配对χ2检验和Kappa检验,考察评价方法和参考方法的检验结果差异是否有统计学意义,以及评价方法与参考方法的检测结果是否有较好的一致性;基因型分布的比较采用χ2检验;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两种方法检测结果 350例标本中,Sanger测序法共检测到ALDH2基因突变116例,其中AA纯合突变13例,GA杂合突变103例,总突变型率为33.1%(116/350),GG野生型234例。AA、GA分别占突变型标本的11.2%和88.8%。ARMS-PCR法共检测到ALDH2基因突变116例,其中AA纯合突变13例,GA杂合突变103例,总突变型率为33.1%(116/350),GG野生型234例。AA、GA分别占突变型标本的11.2%和88.8%。

2.2两种方法的比较 ARMS-PCR法与Sanger测序法的检测结果比较差异无统计学意义(P>0.05),见表2。Kappa检验显示,ARMS-PCR法与Sanger测序法检测结果的一致性较好(Kappa≥0.7,P<0.05)。纯合突变型阳性符合率为100.00%,95%置信区间为75.30%～100.00%;纯合突变型阴性符合率为100.00%,95%置信区间为98.91%～100.00%。杂合突变型阳性符合率100.00%,95%置信区间为96.48%～100.00%;杂合突变型阴性符合率为100.00%,95%置信区间为98.52%～100.00%。野生型阳性符合率为100.00%,95%置信区间为98.44%～100.00%;野生型阴性符合率为100.00%,95%置信区间为96.87%～100.00%。ARMS-PCR法与Sanger测序法对临床标本的检测结果一致性较好,具有等效性。

表2 评价方法与参考方法的检测结果分析(n)

2.2ALDH2基因型与患者性别及年龄的关系 对ARMS-PCR法的检测结果进行分析。207例男性患者中,共检出77例突变,总突变率为37.2%,纯合突变型11例(5.3%),杂合突变型66例(31.9%)。143例女性患者中,共检出39例突变,总突变率为27.3%,其中纯合突变型2例(1.4%),杂合突变型37例(25.9%)。男性和女性患者ALDH2基因突变率分别37.2%和25.9%,但统计分析显示ALDH2基因型分布与性别无关(P=0.083),见表3。

表3 ALDH2基因突变与患者性别及年龄的关系

187例<65岁的患者中,共检出55例突变,总突变率为29.4%,其中纯合突变型6例(3.2%),杂合突变49例(26.2%)。163例≥65岁患者中,共检出61例突变,总突变率为37.4%,其中纯合突变型7例(占4.3%),杂合突变型54例(33.1%)。统计分析显示ALDH2基因型分布与年龄无关(P=0.564)。见表3。

3 讨 论

人ALDH2基因位于染色体12q24.2,长44 kb,含有13个外显子[3]。其编码的ALDH2同时具有硝酸酯类还原酶和乙醛脱氢酶活性,参与硝酸甘油和乙醇的代谢[4-5]。ALDH2基因的12号外显子1510位点具有多态性,表现为G突变为A,导致ALDH2编码的蛋白第487位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸[6]。目前发现3种基因型,包括野生型GG(编码产生的ALDH2酶具有正常活性)、杂合突变型AG(编码的ALDH2只有少量的酶活性)、纯合突变型AA(编码产生的ALDH2几乎没有酶活性)[7]。因此,携带突变等位基因的个体ALDH2酶活性下降,其代谢硝酸甘油的能力下降,硝酸甘油抗心肌缺血的效应减弱,严重影响药物的作用,导致患者服用硝酸甘油无效的风险大幅增加。在国内,ALDH2基因突变率约为30%～50%,但不同地域、不同民族中的ALDH2等位基因的分布存在一定差异[8-11]。因此患者在使用硝酸甘油前进行ALDH2基因检测具有重要意义。为保证治疗效果,突变基因携带者建议慎用硝酸甘油或改用其他药物。

目前市场上检测人ALDH2基因多态性的方法有很多,包括测序法、基因芯片法、荧光定量PCR法、高分辨率溶解技术、高效液相色谱法等[12],而Sanger测序法、ARMS-PCR法是应用较多的方法。Sanger测序法是基因突变检测的金标准,该方法根据双脱氧测序原理,以峰图的形式展现基因碱基序列。相较于其他方法,其最大的优点是可直接检出未知突变,并且检测结果真实可视,质控环节多,准确率高,假阳性概率低;缺点是检测成本高,科室须配置昂贵的测序仪,而且对技术要求高,操作步骤复杂、检测周期时间长,临床应用有一定的局限性[13]。ARMS-PCR法是利用利用特异性引物对已知的突变靶序列进行高精准PCR扩增,同时应用探针对扩增产物进行检测,对野生型和突变型基因进行区分。该方法检测成本较低,设备仅需实时荧光定量PCR仪,实验步骤操作简单,检测周期时间短,而且实验过程中无需开盖操作,避免了交叉污染,适用于临床常规开展。缺点是仅能检测出已知突变位点,无法检测未知突变[14]。

本研究比较了ARMS-PCR法与Sanger测序法检测ALDH2基因突变。研究结果显示,两种方法均能准确有效地检测ALDH2基因突变情况。对ALDH2基因纯合突变型、杂合突变型以及野生型的检测结果总符合率达100.00%,突变型符合率和野生型符合率均为100.00%,说明ARMS-PCR法与Sanger测序法对临床标本的检测结果一致性较好,具有等效性。另外本研究发现在350例患者中,ALDH2基因AA纯合型突变率为3.7%,GA杂合型突变率为29.4%,总突变率为33.1%,与相关文献报道中四川、广州、上海、武汉等地的数据基本一致[15-18]。另外,本研究结果发现ALDH2基因突变与患者性别、年龄均无明显关联,与既往的文献报道一致[8,19-21]。

综上所述,ARMS-PCR法在ALDH2基因突变检测中与Sanger测序法高度一致,结果可靠性高,还具有检测方便、快捷的优点,适用于临床开展ALDH2基因突变检测,可为硝酸甘油的临床用药选择提供有参考依据。