类风湿关节炎患者滑膜组织中p-AKT、Bcl-2、MMP-9的表达水平及临床意义

徐子涵,常文静,周凯伦,吴 楠,王 璇,蔡 辉

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)主要病理特征为慢性持续性滑膜炎症,滑膜细胞增殖,炎性细胞浸润,软骨和骨组织侵蚀、破坏、空洞形成,最终会导致关节结构损伤、畸形和功能丧失[1]。RA滑膜组织增生与成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)过度增殖而凋亡不足的特性有关[2]。磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶(phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信号通路在RA患者滑膜细胞中处于异常激活状态[3],在FLS的生长、增殖、存活、凋亡、黏附和迁移中发挥着重要作用[4]。AKT在PI3K的调控下被磷酸化激活,形成p-AKT,活化下游的相关凋亡因子,如B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)等,从而促进细胞生长、存活,并起到抗凋亡作用[5]。本研究旨在探讨RA患者滑膜组织中p-AKT、Bcl-2、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-9的表达,及其在RA疾病发生发展中的作用及意义。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2013-03至2022-03东部战区总医院骨科住院的RA患者15例(RA组)及同期行膝关节手术的关节损伤患者10例(对照组)。纳入标准:(1)RA组患者诊断符合2010年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟共同发布的RA分类标准[6];(2)对照组选取出院诊断为“韧带损伤、半月板撕裂”的关节损伤患者,同时排除诊断符合RA分类标准;(3)住院期间行膝关节手术,并在手术中留取膝关节滑膜组织标本行病理检查;(4)临床资料完整,病理科标本库中有滑膜组织剩余标本。排除标准:(1)既往有关节手术史;(2)合并感染、癌症、肝肾功能不全、血液系统疾病;(3)其他内分泌、自身免疫病导致的关节炎;(4)病理诊断为色素性绒毛结节性滑膜炎、滑膜肉瘤等其他恶性病变;(5)临床资料缺失、滑膜组织标本缺失。

入组患者滑膜组织标本来源于东部战区总医院病理科剩余石蜡样本,病例临床特征、临床检验结果相关数据采集于东部战区总医院病案管理系统。本研究符合医学伦理学标准,经东部战区总医院伦理委员会审核批准(批号:2022DZGZR-069)。

1.2 方法

1.2.1 临床资料与样本收集 (1)基本信息:性别、年龄、病程;(2)临床检验指标:血常规如WBC计数、中性粒细胞计数(neutrophilic granulocytes,NEUT)、单核细胞计数(monocytes,MONO)、淋巴细胞计数(lymphocytes,LY)、RBC计数、Hb、血小板计数(plastocytes,PLT)、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、类风湿因子(rheumatoid factors,RF)、抗环瓜氨酸肽抗((anti-cyclic citrullinated peptide antibody,anti-CCP);(3)RA组患者根据EULAR制定的改良疾病活动性标准(3变量)[7]计算疾病活动度评分28-3(disease activity score 28-3,DAS28-3)。

1.2.2 仪器与试剂 石蜡切片机(莱卡,德国)、显微影像系统(尼康,日本)、台式高速离心机(Eppendorf,德国);苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂(索莱宝,北京)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的鼠兔通用型二抗(Dako,丹麦)、Bcl-2抗体(Proteintech,武汉,26593-1-AP)、MMP-9抗体(Proteintech,武汉,10375-2-AP)、p-AKT抗体(Proteintech,武汉,66444-1-Ig)。

1.2.3 病理学观察 HE染色法对滑膜组织切片进行染色。将烘烤过的切片用二甲苯脱蜡处理5 min至透明,梯度乙醇洗脱,以去除二甲苯,冲洗后放入蒸馏水中浸洗,稍干后,用苏木精染液染色5～10 min,再放入0.5%盐酸酒精中浸泡10 s,镜检观察。冲洗切片后用伊红染液染色1～2 min,梯度乙醇洗脱。最后经二甲苯浸泡2次,约10 min,使切片透明,用中性树胶封片。于光学显微镜下观察,并按滑膜炎病理Krenn评分标准进行滑膜炎病理评分(表1)。

表1 类风湿关节炎滑膜炎性程度评分标准

1.2.4 滑膜标本免疫组化染色 取组织石蜡标本,进行连续切片,置于载玻片上,制作标本切片;进行脱蜡水化处理,置于二甲苯溶液中浸泡,梯度乙醇水化(无水乙醇、95%、85%、75%),蒸馏水冲洗3遍;进行抗原修复,将切片置于10%柠檬酸盐缓冲液中,高温高压煮沸后继续加热2 min,待其自然冷却后取出切片水洗;放入过氧化氢溶液中浸泡15 min背景封闭;PBS冲洗后,滴加适量稀释抗体p-AKT(1∶200)、Bcl-2(1∶200)、MMP-9(1∶100),4 ℃孵育过夜;PBS冲洗后,滴加适量鼠兔通用型第二抗体,室温下孵育30 min;PBS冲洗后,滴加适量DAB显色液3～5 min,镜下观察,自来水冲洗;苏木精复染5 min,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,封片。

参照免疫组织化学染色(immunohistochemical staining,IHC)技术十三点评分法对切片染色结果进行半定量分析。由病理学专家进行阅片,每张切片随机在400倍镜下选取5个视野,对阳性细胞百分比进行评分:阳性细胞百分比为0,记0分;阳性细胞百分比≤10%,记1分;阳性细胞百分比为11～50%,记2分;阳性细胞百分比为51～75%,记3分;阳性细胞百分比≥76%,记4分。对平均染色强度进行评分:无着色(阴性),记0分;淡黄色(弱),记1分;棕黄色(中),记2分;棕褐色(强),记3分。定义阳性细胞百分比与染色强度两者评分乘积作为每例IHC评分结果。

2 结 果

2.1 一般资料比较 RA组15例,其中男2例,女13例,平均年龄(57.67±10.07)岁。对照组10例,男5例,女5例,平均年龄(47.6±18.38)岁。两组患者在年龄、性别方面差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

2.2 临床指标比较 如表2所示,RA组与对照组患者在LY、RBC、Hb、PLT、ESR方面差异无统计学意义(P>0.05),RA组WBC、MONO、NEUT、CPR、RF、Anti-CCP明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。RA组DAS28-3评分为(4.19±1.02)分,其中缓解期1例,低疾病活动度2例,中疾病活动度9例,高疾病活动度3例。

表2 类风湿关节炎患者(RA组)与对照组临床指标比较

2.3 滑膜组织病理学观察 HE染色结果如图1所示,RA患者滑膜组织中细胞密集,滑膜衬里层增生明显,衬里层厚度可多达十余层,大部分由FLS组成,可见胞浆略丰富,呈淡粉色,细胞核呈蓝紫色。衬里下层见大量血管生成,周围有大量炎性细胞聚集,以淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞为主。对照组患者滑膜组织基本正常,结构清晰,细胞相对稀疏,滑膜衬里细胞形态扁平,呈淡粉色,厚度为2～3层细胞,薄而规整,具有连续性,血管新生较少,无明显炎性细胞浸润。

2.4 滑膜病理评分 按照Krenn评分法对两组患者滑膜组织HE染色进行病理评分,结果如表3所示,RA组患者滑膜组织在炎性细胞浸润、纤维组织增生、滑膜细胞增生、新生血管形成四个方面的评分明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表3 RA组与对照组滑膜HE染色评分

2.5 p-AKT、Bcl-2、MMP-9在两组患者滑膜组织中的表达 IHC染色结果如图2所示,RA滑膜组织中有大量的p-AKT阳性细胞,p-AKT的表达主要定位于胞核,阳性染色呈棕黄色、深褐色颗粒,主要在滑膜下层淋巴细胞表达,滑膜衬里层FLS中染色阳性率较高,染色较深呈棕黄色,血管周围表达不明显,而对照组细胞数量较少,分布相对稀疏,p-AKT阳性细胞数量较少,染色阳性率低,染色略浅,呈淡黄色;RA滑膜组织中有大量的Bcl-2阳性细胞,Bcl-2主要定位在胞浆,主要在炎性细胞、淋巴细胞、浆细胞中表达,滑膜衬里层细胞表达阳性,RA组细胞密度较高,可见滑膜衬里层Bcl-2染色阳性率较高,染色较深呈棕黄色,对照组Bcl-2在纤维区域不表达,多为阴性,整体Bcl-2染色阳性率低,染色浅;RA滑膜组织中有大量的MMP-9阳性细胞,MMP-9主要表达于胞核,少部分在胞浆,在血管周围、肉芽组织中表达明显,滑膜衬里层染色较深,RA组和对照组均有阳性表达,RA组阳性细胞百分率和染色强度均强于对照组。

图1 RA组与对照组滑膜组织病理

图2 RA组与对照组滑膜组织(IHC,×200)

以IHC评分作为IHC蛋白表达半定量结果(表4)。RA组滑膜组织中p-AKT、Bcl-2、MMP-9的IHC评分明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表4 RA组与对照组滑膜组织IHC评分

2.6 p-AKT、Bcl-2、MMP-9蛋白的表达与RA疾病活动指标的关系 结果发现,p-AKT的表达与ESR、DAS28-3呈正相关;Bcl-2的表达与ESR、CRP呈正相关;MMP-9的表达与ESR、DAS28-3呈正相关(表5)。

表5 类风湿关节炎患者p-AKT、Bcl-2、MMP-9蛋白的表达与RA疾病活动指标的相关性

2.7 RA患者滑膜组织中p-AKT、Bcl-2、MMP-9之间的表达关系 Bcl-2与MMP-9的表达呈正相关(r=0.630,P=0.012),差异有统计学意义。p-AKT与Bcl-2的表达之间无明显相关(r=0.443,P=0.098),p-AKT与MMP-9的表达之间无明显相关(r=0.488,P=0.065)。

3 讨 论

RA是一种慢性全身性炎症性疾病,据统计1986至2014年全球患病率为0.46%[8],多见于女性,可发生于任何年龄,发病高峰在50～60岁[9]。为降低性别、年龄因素对相关检测结果的影响,在本研究中两组患者性别、年龄相近,具有可比性。本研究中纳入的病例RA组患者CRP、RF、Anti-CCP检测值明显高于对照组,这与RA的临床特征相符[10, 11]。本研究纳入的RA患者大部分仍处于疾病活动状态,并且多处于RA晚期,入组患者的滑膜组织标本一定程度上能反映RA病理特征。本研究中对两组患者滑膜组织切片进行HE染色及Krenn评分,RA组镜下观察符合RA组织病理学特点,与对照组差异明显。

AKT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,经不同生长因子和细胞外刺激后,可介导细胞增殖、存活、葡萄糖代谢、蛋白质合成、基因组稳定性、凋亡抑制等多种生物学功能[12]。PI3K是一种参与细胞生长和骨骼重塑的重要磷脂酰肌醇激酶,也是一种重要的抗凋亡调节剂,激活下游AKT。通过磷酸化,p-AKT可以进一步激活或抑制下游靶蛋白caspase-3、Bcl-2、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapamycin target protein,mTOR)等,参与细胞凋亡和代谢的调节[13, 14]。Zhang等[15]发现,RA患者滑膜组织中PI3K/AKT信号通路处于激活状态。本研究通过IHC染色检测p-AKT在滑膜组织中的表达,结果显示RA滑膜组织中有大量的p-AKT阳性细胞,并且与对照组相比,RA患者滑膜组织p-AKT的IHC评分明显升高,差异有统计学意义,提示RA滑膜组织中存在AKT相关信号通路的活化,这与既往研究所发现的AKT信号通路在RA关节滑膜的过度激活相一致。

Bcl-2的表达升高与细胞凋亡的减少有关,在RA中,FLS在滑膜下层中的比例较高,并且表现出Bcl-2表达增加、细胞凋亡抗性和异常增殖[16]。在纳入本研究的RA患者滑膜中检测到Bcl-2的高表达,滑膜衬里层的表达明显,提示RA滑膜细胞存在细胞凋亡减少。MMPs作为一类蛋白水解酶,促进炎症细胞向关节滑膜募集,从而促进血管翳的形成[17]。过表达的MMPs可导致RA大鼠的细胞外基质降解和关节软骨破坏。有学者认为MMP-3可作为Anti-CCP阴性RA早期诊断的潜在标志物,是RA病情评价、疾病活动度分层和预后的重要指标[18]。MMP-9是MMPs家族中的重要一员,Grillet等[19]在RA患者的滑液中检测到含有高水平的MMP-9,包括其截断和瓜氨酸化的蛋白质形式。本研究在RA患者滑膜组织中检测到MMP-9的高表达,可见FLS过度增生和凋亡不足,使FLS分泌更多MMPs导致更严重的组织破坏。

RA临床症状可见关节肿胀、压痛、晨僵等,临床检验常见RA特异性自身抗体(RF、Anti-CCP)阳性,CRP、ESR水平升高,从而反映患者疾病状态[20]。本研究显示RA滑膜组织中p-AKT、Bcl-2、MMP-9的表达与ESR呈正相关,Bcl-2的表达与CRP呈正相关,p-AKT、MMP-9的表达与DAS28-3呈正相关。可见p-AKT、Bcl-2、MMP-9的表达升高提示患者RA疾病活动进展,表明p-AKT、Bcl-2、MMP-9在评估RA疾病发生发展中具有辅助作用。

综上,RA患者滑膜组织中p-AKT、Bcl-2、MMP-9的表达增加,与RA疾病活动相关指标呈正相关。RA患者关节滑膜组织中滑膜过度增殖,可能与AKT相关信号途径的激活、凋亡抑制蛋白Bcl-2过表达有关。