优化脂肪间充质干细胞外泌体提取方法的研究*

韩 悦,耿承奎,张鑫瑞,雷 蕾,刘建宇

(1.云南中医药大学,云南 昆明 650000;2.昆明医科大学附属医院延安医院骨科,云南 昆明 650000)

来源广泛,取材方便、不涉及免疫排斥和伦理学问题等显著优势,使脂肪间充质干细胞(adipose-derived stromal cell,ADSCs)逐渐在近几年的再生医学领域研究中脱颖而出[1]。但其细胞移植到体内的存活率低严重限制了间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSCs)的修复潜能,且储存条件较苛刻,运输不便,临床应用较困难[2]。外泌体是由双层磷脂分子层包围,呈现典型茶杯状结构的囊泡。外泌体内部含有四跨膜蛋白家族(CD63,CD81 和CD9)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)等多种蛋白[3]及一些核酸以及脂质分子[4]。外泌体相比间充质干细胞,具有更加稳定、安全、低免疫原性的优点,且更便于运输和储存[5],因此外泌体成为了以MSC为基础,更卓越的新选择[6]。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

100KD 超滤管(millipore);外泌体提取试剂盒(invitrogen);间充质干细胞胎牛血清、无外泌体胎牛血清,DMEM/F12培养基(vivacell,原BI);兔抗鼠TSG101、CD9 抗体(Proteintech)

1.2 实验方法

1.2.1 分离提取与培养大鼠原代ADSCs

1.2.1.1 大鼠原代ADSCs的分离提取

组织块贴壁法:(1)选择 3～4 周龄的雌性大鼠(Sprague-Dawley,SD),将其两侧腹股沟下脂肪组织分离下来。(2)放入装有磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)的离心管里,用含双抗的 1*PBS充分冲洗脂肪组织 3～4 次[7]。(3)将组织剪成1*1*1 mm大小后均匀分布在培养皿中。(4)在超净台里放置 15～20min干燥脂肪块,缓慢滴加10mL完全培养基后置于 37℃,5% CO2培养箱,每天观察脂肪贴块周围细胞爬出情况和细胞形态。培养 48 h 后换液,去除悬浮细胞,所得细胞即为原代ADSCs。

1.2.1.2 ADSCs的培养

将P3～6 代的ADSCs在T75的培养瓶中进行培养,2d进行一次换液。用完全培养基(体积分数为 10% 间充质干细胞FBS +1% 双抗溶液 + DMEM/F12 培养基)培养增殖至85%～90%汇合时,改加入不含外泌体的间充质干细胞培养基(体积分数为 10% 不含外泌体的间充质干细胞FBS +1%双抗溶液 + DMEM/F12 培养基),继续培养48h[8],48h后收集细胞上清,将其分装放置于 50mL 离心管中,并于-80℃的温度下保存备用。

1.2.2 外泌体的提取

用 100kDa 的超滤管对收集的细胞上清进行浓缩,以2000*g离心浓缩过的细胞上清30min,以去除细胞和碎片,加入50%细胞培养基体积的总外泌体分离试剂,混合均匀后于4℃冰箱孵育过夜,以 4℃,10000*g 离心1h后,用200μL 1*PBS重悬管壁的沉淀物,将所得的外泌体悬液放在-80℃的温度下保存备用。

1.2.3 外泌体的鉴定

1.2.3.1 透射电镜观察外泌体大体形貌

取上述20uL外泌体悬液,滴于载样铜网上,保留2min后用磷钨酸溶液负染固定 5min,用滤纸吸干液体后自然干燥,观察外泌体形貌、尺寸,并将其拍摄下来。

1.2.3.2 粒度仪检测粒径尺寸及浓度

样本池用去离子水清洗;取样本以1*PBS buffer稀释,进样检测。

1.2.3.3 蛋白质印迹法检测外泌体膜蛋白CD9、TSG101表达

对外泌体悬液进行裂解,收集的蛋白质样品在 10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中电泳,溴酚蓝到达胶的底端后将电泳的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(PolyVinylideneFluoride,PDVF)上(300mA,60min),并在室温下用 5% 脱脂奶粉封闭,加入CD9、TSG101一抗在 4 ℃摇床孵育过夜,洗涤印迹,回收一抗后在室温下与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育 1 h,于显影仪检测蛋白表达。

1.2.3.4 BCA蛋白浓度检测法(bicinchoninic acid,BCA)测蛋白含量

将外泌体悬液于冰上裂解30min后,按 BCA 试剂盒说明书详细步骤测定外泌体悬液的蛋白浓度。样本品孔加入5μL外泌体悬液,重复两个复孔,蛋白稀释液定容至20μL,加入 BCA 工作液于37 ℃培养箱孵育30 min,用酶标仪测定各孔在 562 nm 处吸光度值,绘制标准曲线代入R2公式测算出外泌体悬液的蛋白浓度。

2 结果

2.1 大鼠ADSCs形态学

从第2d起可观察到从脂肪组织块周围陆续有细胞爬出贴壁,主要以长梭形为主,有一些为多角形,细胞生长状态旺盛时,呈旋涡状、鱼群状,见图1。

图1 大鼠ADSCs在倒置显微镜下的形态注:图A为大鼠原代ADSCs培养3 D的状态,见少量细胞逐渐从组织块周围爬出,呈梭形;图B为大鼠原代ADSCs培养7D的状态,可见大量细胞从组织块爬出;图C为第3代大鼠ADSCs。

2.2 外泌体表征

2.2.1 大鼠脂肪间充质干细胞源性外泌体的形态学特征

提取的外泌体在透射电镜观察下呈典型的茶杯型结构。可见外泌体是具有双层膜包绕的囊泡结构,中央为低电子密度成分,分布较集中且边界清晰,直径约为100nm左右,见图 2。

图2 提取外泌体在透射电镜下的形态学特征

2.2.2 粒度仪检测粒径分布峰值、大小、浓度

外泌体粒径分布峰值为 112.2nm,浓度为7.5×1011 粒子/mL,外泌体平均直径在70～140nm之间,见图 3。

图3 粒度仪测定提取外泌体粒径分布

2.2.3 Western blot检测结果

ADSCs来源外泌体表面标记蛋白CD9(+)TSG101(+),见图 4。

图4 蛋白质印迹法分析外泌体表面标记蛋白:CD9(+),TSG101(+),为外泌体典型特征

2.2.4 1000mL大鼠ADSCs的细胞上清浓缩后,与外泌体提取试剂盒共同孵育离心,用200μL的1*PBS重悬形成的外泌体悬液经BCA法测定浓度为7.66mg/mL,见图5。

图5 BCA法测定蛋白含量

3 讨论

目前很多方法可以提取外泌体,包括超滤法、密度梯度离心、尺寸排除色谱法、聚合物沉淀法等。超滤法被称为分离提取外泌体的“金标准”,但其费时费力,需要用到昂贵的超速离心机,过度超离还会导致外泌体破裂;密度梯度离心法是由超离法改良升级的[9],同时也存在着花费时间长、操作繁琐、技术要求高、得率低、需要昂贵的超速离心机等问题;聚合物沉淀法纯度极低,杂蛋白多,外泌体易受到脂蛋白或病毒颗粒的污染,可能对随后的分析(例如蛋白质组学)产生不利影响;尺寸排除色谱法需要昂贵的色谱仪器、不适合大体积样本。

随着外泌体相关研究的逐渐火热,一些公司针对以上方法的缺陷研制了简单快速提取外泌体的试剂盒,大多数可以大大提高完整外泌体的回收率,灵活性极佳。但外泌体提取试剂盒一般量少(50mL左右),且价格昂贵。对外泌体提取需求量大且没有超速离心机等昂贵设备的研究者可以选择先将细胞上清用100KD的超滤管浓缩后,再使用外泌体提取试剂盒,这种方法可以大大节省外泌体提取试剂盒的用量,节约成本,经济划算且效率高。但目前商用提取试剂盒的应用仍存在很多挑战[10],如不同厂家性能不一,提取纯度不一,所提质量无法保证,尚缺乏能够同时实现高通量、高纯度、高回收率和高性价比的外泌体分离方法。本研究使用外泌体提取试剂盒的优化方法提取大鼠脂肪间充质干细胞源性外泌体,旨在为后续外泌体在实验研究及临床应用上寻找出一条简便高效提取外泌体的途径,奠定技术基础。