LncRNA KCNQ1OT1调控miR-10a-5p加重缺氧复氧H9c2细胞损伤的机制

程涛 赵沱 杨洁

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的病情发展迅速,死亡率高[1]。临床上首选经皮冠状动脉介入法治疗,常伴随心肌缺血再灌注损伤[2]。缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是人体许多疾病的一种重要病理过程,尤其是心肌梗死[3]。长非编码RNA(LncRNAs)为长度>200个核苷酸的非编码转录本,其与各种生物过程密切相关,如细胞生长、分化、增殖和凋亡[4]。研究表明LncRNAs可以调节多种心血管疾病的病理生理过程,包括心肌梗死、心力衰竭[5]。LncRNA KCNQ1重叠转录本1(KCNQ1 overlapping transcript 1,KCNQ1OT1)在糖尿病心肌病、心肌梗死、缺血再灌注心肌损伤中表达均异常上调,不利于细胞的存活[6,7]。本研究探讨KCNQ1OT1调控缺氧复氧(hypoxia reoxygenation,H/R)心肌细胞增殖、凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 H9c2细胞购自中国(上海)科学研究院细胞库;EMDM培养液购自美国Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青;LipofectamineTM3000试剂购自中国赛默飞世尔科技;细胞计数试剂盒(CCK8)购自日本同仁;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和碘化丙锭(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒购自武汉普诺赛生物;RⅡPA裂解液、Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物;兔抗P65单克隆抗体、兔抗PHB多克隆抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗Bax多克隆抗体及HRP标记的山羊抗兔二抗购自上海艾博抗体;ECL超敏化学发光试剂盒购自北京普利莱基因生物;RNA提取液Trizol购自美国Invitrogen公司;实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)试剂盒购自北京天根生物;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翌圣生物;所有引物的设计合成及antagomiRNA、antagomiR-10a-5p、agomiRNA、agomiR-10a-5p的设计合成均委托上海吉玛完成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：H9c2细胞用含有10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养液培养,在37℃、5% CO2的培养箱中常规培养,隔天更换1次培养液。

1.2.2 转染与分组：正常培养的H9c2细胞设为H9c2组;将H9c2细胞常规培养12 h,更换至5%CO2、95%N2的培养箱中缺氧培养4 h,再复氧常规气体培养6 h,设为H/R H9c2组;使用LipofectamineTM3000试剂将pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-KCNQ1OT1组(转染pcDNA-KCNQ1OT1)、antagomiRNA组(转染antagomiRNA)、antagomiR-10a-5p组(转染antagomiR-10a-5p)、pcDNA-KCNQ1OT1+agomiRNA组(共转染pcDNA-KCNQ1OT1和agomiRNA)、pcDNA-KCNQ1OT1+agomiR-10a-5p组(共转染pcDNA-KCNQ1OT1和agomiR-10a-5p)按照1∶5加入转染试剂转染12 h,进行缺氧复氧培养。RT-qPCR实验确定转染的效率,成功后方用于后续实验。

1.2.3 CCK8实验：收集细胞,用细胞培养液调整至5×104个/μl。取200 μl至96孔板,加入CCK溶液20 μl,震荡混匀,避光孵育20 min。酶标仪上490 nm波长下检测吸光度(OD490)。细胞活性=OD490实验组/ OD490 对照组×100%。

1.2.4 流式细胞术实验：收集细胞,PBS洗涤4次,用500 μl结合缓冲液悬浮细胞。取出Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒中的Annexin V-FITC、PI,按照说明书使用方法要求操作,加入5 μl的 Annexin V-FITC和5 μl的PI避光孵育20 min。用流式细胞仪检测分析细胞的凋亡情况。细胞总凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.5 Western blot实验：将细胞用裂解缓冲液收集,再加上RIPA裂解液冰上裂解30 min,提取总蛋白。用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分离。结束后通过湿转法将蛋白转移至NC膜,转膜仪器维持在0℃。将载有蛋白的NC膜用含有3%脱脂奶粉Tris缓冲盐水吐温-20(TBST)封闭液,37℃封闭处理1 h。用TBST溶液充分洗膜3次,再加入稀释过的一抗溶液,至淹没膜,4℃冰箱孵育过夜。取出膜,同样洗膜3次,滴加稀释的二抗溶液,37℃孵育2 h。ECL超敏化学发光试剂盒显影,Quantity One 4.62图像分析Image J软件评价蛋白灰度。β-actin作为内部参考,目标条带的灰度值与内部参考条带的灰度值之比表示蛋白质的相对表达。

1.2.6 RT-qPCR实验：收集需要检测的细胞,Trizol液提取RNA,并用反转录试剂盒合成cDNA。以此作为模板,用RT-qPCR试剂盒检测模板中KCNQ1OT1、miR-10a-5p的表达情况。结果以GAPDH、U6为内参,2-ΔΔCt法计算KCNQ1OT1、miR-10a-5p的相对表达量。程序设置为：94℃,2 min;94℃, 30 s; 58℃, 30 s; 72℃, 30 s;2℃,2 min。共45个循环。引物信息为：KCNQ1OT1：F：5’-CGCGATCCTCCTCAGTGTTT-3’,R：5’-CATATCG CCGACCACCATGA-3’;miR-10a-5p：F：5’-CGCTACCCTGTAGATCCGAATTTGTG -3’,R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;GAPDH、U6为通用引物。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测实验：靶基因预测网站Starbase(https：//starbase)预测miR-10a-5p的靶点,发现KCNQ1OT1为其靶基因之一。合成KCNQ1OT1-WT(含有KCNQ1OT1结合位点)和KCNQ1OT1-MUT(不含有KCNQ1OT1结合位点),在插入荧光载体,构建荧光报告基因载体。将含有KCNQ1OT1-WT和KCNQ1OT1-MUT的荧光载体与miR-NC、miR-10a-5p、anti-miR-NC、anti-miR-10a-5p共转染至H9c2。使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞的荧光活性,结果以萤火虫荧光荧光素酶的活性为内参,海参荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶的发光强度的比值表示KCNQ1OT1与miR-10a-5p的靶向结合能力。

2 结果

2.1 H/R H9c2细胞模型的建立 与H9c2组比较,H/R H9c2组细胞活性显著降低,凋亡率显著升高,P65、Bcl-2的相对蛋白表达显著降低,PHB、Bax的相对蛋白表达显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1,图1。

图1 H/R H9c2细胞凋亡及P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白;A H/R H9c2细胞凋亡;B P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白

表1 H/R H9c2细胞的活性、凋亡及相关的蛋白的相对表达量 n=9,

2.2 KCNQ1OT1、miR-10a-5p在H/R H9c2细胞中的表达 与H9c2组比较,H/R H9c2组细胞KCNQ1OT1表达显著升高,miR-10a-5p表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 KCNQ1OT1、miR-10a-5p在H/R H9c2细胞中的相对表达量 n=9,

2.3 过表达KCNQ1OT1对H/R H9c2细胞活性、凋亡的调控 与pcDNA组比较,pcDNA-KCNQ1OT1组H/R H9c2细胞KCNQ1OT1表达显著升高,细胞活性显著降低,凋亡率显著升高,P65、Bcl-2的蛋白表达显著降低,PHB、Bax的蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表3,图2。

图2 过表达KCNQ1OT1的H/R H9c2细胞凋亡及P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白;A 过表达KCNQ1OT1的H/R H9c2细胞凋亡;B P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白

表3 过表达KCNQ1OT1的H/R H9c2细胞活性、凋亡及相关的蛋白的相对表达量 n=9,

2.4 LncRNA KCNQ1OT1靶向miR-10a-5p 通过生物信息学在线预测网站Starbase预测到KCNQ1OT1与miR-10a-5p之间存在互补的结合位点。双荧光素酶报告结果,与miR-NC组比较,miR-10a-5p组LncRNA KCNQ1OT1-WT细胞的荧光活性显著降低(P<0.05);与miR-NC组相比,miR-10a-5p组KCNQ1OT1表达显著降低,与anti-miR-NC组相比,anti-miR-10a-5p组KCNQ1OT1表达显著升高(P<0.05)。见图3,表4。

图3 LncRNA KCNQ1OT1靶向miR-10a-5p

表4 双荧光素酶报告实验结果 n=9,

2.5 抑制miR-10a-5p对H/R H9c2细胞活性、凋亡的调控 与antagomiRNA组比较,antagomiR-10a-5p组H/R H9c2细胞miR-10a-5p表达显著降低,细胞活性显著降低,凋亡率显著升高,P65、Bcl-2的蛋白表达显著降低,PHB、Bax的蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图4,表5。

图4 抑制miR-10a-5p的H/R H9c2细胞凋亡图及P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白;A 抑制miR-10a-5p的H/R H9c2细胞凋亡;B P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白

表5 抑制miR-10a-5p的H/R H9c2细胞活性、凋亡及相关的蛋白的相对表达量 n=9,

2.6 过表达miR-10a-5p部分逆转过表达KCNQ1OT1对H/R H9c2细胞活性、凋亡的调控 与pcDNA-KCNQ1OT1+agomiRNA组比较,pcDNA-KCNQ1OT1+agomiR-10a-5p组H/R H9c2中KCNQ1OT1的表达显著降低,细胞活性显著升高,凋亡率显著降低,P65、Bcl-2的相对蛋白表达显著升高,PHB、Bax的相对蛋白表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表6,图5。

图5 过表达miR-10a-5p和KCNQ1OT1的H/R H9c2细胞凋亡及P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白;A 过表达miR-10a-5p和KCNQ1OT1的H/R H9c2细胞凋亡;B P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白

表6 过表达miR-10a-5p和KCNQ1OT1的H/R H9c2细胞活性、凋亡及相关的蛋白的相对表达量 n=9,

3 讨论

很多研究证实KCNQ1OT1在心脏疾病中具有重要作用[8,9],但是其发挥作用的机制仍在继续探究。Zhang等[10]发现,KCNQ1OT1在急性心肌梗死区和交界区的组织中表达均显著升高,并且抑制KCNQ1OT1可保护心肌细胞免受缺氧损伤,揭示KCNQ1OT1通过分泌miR-466k和miR-466i-5p,进而上调茶结构域转录因子1(Tead1)达到心肌细胞缺氧损伤。Li等[11]在缺血再灌注对心肌细胞损伤的研究中发现,KCNQ1OT1的表达显著上调,抑制KCNQ1OT1可降低损伤心肌细胞炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌和凋亡,这与KCNQ1OT1抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路活性直接联系;除此之外,KCNQ1OT1的这些功能可被敲减AdipoR1逆转,说明KCNQ1OT1还可通过上调AdipoR1预防心肌的缺血再灌注损伤。本研究成功建立了缺氧复氧H9c2细胞损伤模型,RT-qPCR实验检测其中KCNQ1OT1的表达,发现KCNQ1OT1显著升高,与Zhang等[10,11]的研究结果相一致,再次验证KCNQ1OT1参与心肌缺血再灌注损伤。为探讨KCNQ1OT1在缺氧复氧H9c2细胞生存中的功能,通过转染KCNQ1OT1建立过表达KCNQ1OT1的H9c2细胞,发现受损的H9c2细胞活性更低,细胞凋亡能力更强,P65、Bcl-2的表达更低,PHB、Bax的表达更高,加重H/R对H9c2的损伤,说明KCNQ1OT1在心肌损伤过程中扮演重要角色。本研究发现,KCNQ1OT1靶向负调控miR-10a-5p,猜测miR-10a-5p可能与KCNQ1OT1损伤心肌有关。

miR-10a-5p在心血管疾病中的功能已有很多学者研究,尤其是缺血再灌注心肌损伤[12,13]。Dong等[14]通过慢病毒介导的体外老化hBM间充质干细胞(MSCs)中miR-10a的上调和KLF4的下调发现,miR-10a可通过抑制KLF4-BAX/BCL2信号通路减少缺氧诱导的细胞凋亡并提高老化hBM MSCs细胞的存活率;在体内,过表达miR-10a的老年人骨髓间充质干细胞移植可促进移植干细胞存活,改善心肌梗死;过表达miR-10a的老化hBM MSCs可激活Akt并刺激血管生成因子的表达,增加缺血小鼠心脏的血管生成,揭示miR-10a可使老化hBM MSCs恢复活力,改善缺血小鼠心脏的血管生成和心脏功能。Cao等[15]报道,miR-10a-5p在H/R H9c2细胞和MI小鼠心肌中低表达,并且作为MIAT的下游靶点和EGR2的上游调控因子参与心肌细胞的凋亡、ATP含量,调节心肌梗死后心肌的损伤,揭示MIAT通过与miR-10a-5p/EGR2通路参与心肌梗死的作用机制,暗示miR-10a-5p、MIAT在心肌梗死基因靶向治疗中的潜力。本研究通过检测H/R H9c2细胞中miR-10a-5p的表达发现,miR-10a-5p表达明显降低,下调miR-10a-5p可加重H/R对H9c2细胞的活性抑制和凋亡促进作用,并且过表达miR-10a-5p能够部分逆转过表达KCNQ1OT1对H/R H9c2细胞的活性抑制、凋亡促进作用。

综上所述,长链非编码RNA KCNQ1OT1在缺氧复氧心肌细胞中高表达,可加重缺氧复氧对心肌细胞的损伤,其作用机制与靶向抑制miR-10a-5p相关,为缺血再灌注心肌损伤的靶向治疗奠定基础。