普鲁卡因通过调控PRMT5对肺癌细胞的增殖和凋亡的影响

付滨 余学英 刘星 邱德亮 肖天科 张科

肺癌主要受吸烟、遗传、大气污染和电离辐射等因素的影响,在早期临床的表现症状不明显,常因为患者不重视或误诊等,导致出现较高的死亡率[1,2]。虽然近年来肺癌在治疗上取得了较大的进展,但是肺癌患者的预后效果不甚理想。麻醉药在肿瘤治疗方面被广泛应用,麻醉药物咪达唑仑、阿片类药物和利多卡因等在一定程度能够抑制肺癌细胞的生长、复发和转移[3]。普鲁卡因是一种脂溶性的局部麻醉药物,具有毒性低、价格便宜等优点,在抗肿瘤方面具有一定的作用[4],如普鲁卡因调控SOX9的表达抑制乳腺癌细胞的增殖和诱导细胞的凋亡[5]。普鲁卡因还可以抑制非小细胞肺癌的增殖,降低PCNA蛋白、EGFR mRNA的表达[6],但是对凋亡的研究尚不明确。蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)在多种癌症中高表达,如卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌和肺癌等,与肿瘤的预后密切相关[7]。Li等[8]研究结果显示,PRMT5在肺癌组织和细胞中表达上调,敲低PRMT5可以明显抑制肺癌细胞的增殖和诱导其细胞凋亡;白藜芦醇通过调控PRMT5/Akt/Gsk3β信号通路促进肺癌细胞的发展。本研究通过体外培养肺癌细胞A549,探讨普鲁卡因是否可以调控PRMT5的表达影响肺癌细胞的增殖和凋亡的影响,为肺癌的研究提供合理的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 肺癌细胞A549购自中国科学院上海细胞库;胎牛血清、EMDM培养基购自美国Hyclone公司;盐酸普鲁卡因注射液购自常州兰陵制药公司,规格：10 ml/0.1 g;si-NC、si-PRMT5、pcDNA和PRMT5购自上海生工公司;MTT试剂盒、凋亡试剂盒购自北京索莱宝公司;PCNA抗体、p21抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、PRMT5抗体和GAPDH抗体购自美国Cell Signaling公司;LipofectamineTM2000试剂盒购自美国购自Sigma公司;Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、AceQ qPCR SYBR®Green Mix试剂盒购自日本TaKaRa公司;引物购自上海吉玛公司。

1.2 细胞培养与分组 将肺癌细胞A549复苏后在含有10%胎牛血清的EMDM培养基内,并设置培养箱温度为37℃、5% CO2,观察肺癌细胞A549的生长状态,加入胰酶进行消化传代培养。收集生长状态良好的肺癌细胞A549接种在96孔板内,采用浓度为0、1.0、2.5、5.0 mmol/L的普鲁卡因处理肺癌细胞A549,记为0 mmol/L组、1.0 mmol/L组、2.5 mmol/L组、5.0 mmol/L组,其中0 mmol/L、5.0 mmol/L的普鲁卡因记为对照组和普鲁卡因组。将si-NC和si-PRMT5转染至未处理的肺癌细胞A549内,记为si-NC组和si-PRMT5组;pcDNA和PRMT5转染肺癌细胞A549后经过5.0 mmol/L的普鲁卡因处理,记为普鲁卡因+pcDNA组和普鲁卡因+PRMT5组。

1.3 MTT检测细胞的活力 取出各组的肺癌细胞A549,PBS冲洗3遍,1 000 r min离心5 min,除去上清液,制成1×105个/ml浓度的细胞悬液接种在96孔板内。在培养箱中固定培养48、72 h,每孔加入20 μl的MTT溶液,继续孵育4 h,除去孔内液体加入150 μl DMSO溶液。酶标仪490 nm检测细胞的吸光度值。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 取出各组的肺癌细胞A549,室温下1 000 r/min离心5 min,采用预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞,1 000 r/min离心5 min后加入300 μl磷酸盐缓冲液,与5 μl的Annexin V-FITC和PI溶液,避光反应15 min。流式细胞仪检测细胞的凋亡。

1.5 Western blot检测PCNA、p21、Bcl-2、Bax和PRMT5蛋白表达 取出各组的肺癌细胞A549,预冷后加入蛋白裂解液,离心后去细胞上清液,按照BCA法定量蛋白浓度,将蛋白样品加入到10% SDS-PAGE凝胶处理,转膜,加入5%脱脂奶粉封闭培养,加入PCNA、p21、Bcl-2、Bax和PRMT5一抗,稀释比例为1∶1 000,过夜孵育,加入二抗(1∶5 000),室温下孵育1 h。在PVDF膜上加入发光液和增强液,采用Image J分析蛋白条带的灰度值,选择β-actin为内参计算相对表达量。

1.6 qRT-PCR检测PRMT5 mRNA的表达 取出各组的肺癌细胞A549按照Trizol法提取细胞的总RNA,在紫外分光光度计260 nm和280 nm处检测吸光度比值。取2 μg的RNA加入在反应体系中,按照逆转录试剂盒合成cDNA,将合成的模板按照AceQ qPCR SYBR®Green Mix试剂盒进行PCR扩增。GAPDH作为内参,通过2-ΔΔCt法计算PRMT5 mRNA的表达。PRMT5正向引物为：5’-CCTGTGGAGGTGAACACAGT-3’,反向引物为：5’-AGAGGATGGGAAACCATGAG-3’;GAPDH正向引物为：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’,反向引物为：5’-TGCCATGGGTGGAATCATATTGG-3’。选择GAPOH为内参计算相对表达量。

2 结果

2.1 普鲁卡因对肺癌细胞增殖的影响 随着普鲁卡因浓度的增加,肺癌细胞的OD值、PCNA蛋白表达逐渐降低(P<0.05),p21蛋白表达逐渐升高(P<0.05)。见表1,图1。

图1 普鲁卡因对肺癌细胞中PCNA、p21蛋白的影响

表1 普鲁卡因对肺癌细胞增殖的影响

2.2 普鲁卡因对肺癌细胞凋亡的影响 随着普鲁卡因浓度的增加,肺癌细胞的凋亡率、Bax蛋白表达逐渐升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达逐渐降低(P<0.05)。见图2,表2。

图2 普鲁卡因对肺癌细胞凋亡的影响;A Bax、Bcl-2蛋白表达;B 细胞凋亡率

表2 普鲁卡因对肺癌细胞凋亡的影响

2.3 抑制PRMT5对肺癌细胞增殖的影响 与si-NC组比较,si-PRMT5组的PRMT5 mRNA和蛋白表达、OD值、PCNA蛋白表达显著降低(P<0.05),p21蛋白表达显著增加(P<0.05)。见表3,图3。

图3 抑制PRMT5对肺癌细胞中PRMT5、PCNA、p21蛋白的影响

表3 抑制PRMT5对肺癌细胞增殖的影响

2.4 普鲁卡因处理肺癌细胞后PRMT5的表达 随着普鲁卡因浓度的增加,肺癌细胞中PRMT5 mRNA和蛋白表达逐渐降低(P<0.05)。见表4,图4。

图4 普鲁卡因处理肺癌细胞后PRMT5蛋白的表达

表4 普鲁卡因处理肺癌细胞后PRMT5的表达

2.5 抑制PRMT5对肺癌细胞增凋亡的影响 与si-NC组比较,si-PRMT5组细胞凋亡率、Bax和Bcl-2蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5,表5。

表5 抑制PRMT5对肺癌细胞增凋亡的影响

2.6 普鲁卡因通过调控PRMT5对肺癌细胞的增殖和凋亡的影响 与对照组比较,普鲁卡因组的PRMT5 mRNA及蛋白表达、OD值、PCNA蛋白表达、Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),细胞凋亡率、p21蛋白表达、Bax蛋白表达明显增加(P<0.05);与普鲁卡因+pcDNA组比较,普鲁卡因+PRMT5组的PRMT5 mRNA及蛋白表达、OD值、PCNA蛋白表达、Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05),细胞凋亡率、p21蛋白表达、Bax蛋白表达明显降低(P<0.05)。见图6,表6。

图6 普鲁卡因通过调控PRMT5对肺癌细胞的增殖和凋亡的影响;A PRMT5、PCNA、p21、Bax、Bcl-2蛋白表达;B 细胞凋亡率

表6 普鲁卡因通过调控PRMT5对肺癌细胞的增殖和凋亡的影响

3 讨论

普鲁卡因是一种具有毒副作用小、较为安全的局部麻醉药物,能够激活抑癌或促癌因子,发挥抗肿瘤的药理活性,在肝癌、胃癌和乳腺癌等癌症治疗中取得了效果,可以抑制肿瘤细胞的生长,为肿瘤治疗提供新的药物研究方向[9,10]。金翠红等[11]研究结果显示,普鲁卡因能够通过调控TRAIL抑制宫颈癌细胞的增殖和诱导细胞的凋亡。曾凯辉等[12]研究结果显示,普鲁卡因能够抑制CXCR7/AKT/STAT3通路进而抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。方洁等[13]研究结果显示,普鲁卡因能够调控FSCN1抑制膀胱癌细胞的增殖和阻滞细胞周期,并诱导细胞的凋亡。Li等[14]研究结果显示,普鲁卡因能够抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移,促进细胞的凋亡,阻滞细胞周期,普鲁卡因通过抑制RhoA/ERK/MAPK/FAK通路发挥在结直肠癌细胞中的作用。有研究发现,普鲁卡因能够上调miR-133b的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移,促进细胞的凋亡[15]。本研究结果显示,普鲁卡因可以抑制肺癌细胞的增殖、增加肺癌细胞的凋亡,上调p21、Bax蛋白表达,下调PCNA、Bcl-2蛋白表达,说明普鲁卡因能够抑制肺癌细胞的增殖和诱导细胞的凋亡。

PRMT5是PRMT家族的主要成员之一,可以参与基因转录后调控、细胞增殖、分化、凋亡等过程[16]。PRMT5是一种表观的遗传酶,在蛋白白质甲基化中具有重要的作用,可以多种癌症的促癌基因,参与肿瘤的发发展[17],如PRMT5在肝癌细胞中表达上调,抑制PRMT5能够抑制肝癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡[18]。燕飞虎等[19]研究结果显示,PRMT5在胃癌组织中表达上调,高表达PRMT5与胃癌细胞的肿瘤分级、分期和淋巴结转移有关,抑制PRMT5能够明显降低胃癌细胞的增殖、迁移能力,并促进其细胞的凋亡。Zhang等[20]研究结果显示,PRMT5在肺癌组织中表达上调,敲低PRMT5能够下调cyclin E1和cyclin D1蛋白表达抑制肝癌细胞的增殖。侯从岭等[21]研究结果显示,槐角黄铜通过调控miR-188-5p/PRMT5轴促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示,采用不同浓度的普鲁卡因处理肺癌细胞A549后,PRMT5 mRNA和蛋白表达下调,利用siRNA干扰技术,发现抑制PRMT5可以降低肺癌细胞的增殖能力,促进肺癌细胞的凋亡,上调p21、Bax蛋白表达,下调PCNA、Bcl-2蛋白表达,说明PRMT5在肺癌细胞中起到促癌的作用。进一步实验结果显示,过表达PRMT5可以部分回复普鲁卡因对肺癌细胞的增殖和凋亡的影响,说明普鲁卡因通过调控PRMT5发挥在肺癌细胞中作用。

综上所述,普鲁卡因通过下调PRMT5表达抑制肺癌细胞的增殖,促进细胞的凋亡,为肺癌细胞的治疗提供新的思路。