阿尔兹海默病诊断标志物的研究进展

白茹 何婷 谢能

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),是一类和年龄相关的中枢神经系统变性病变,在病程上存在进行性慢性特点,主要表现为进行性认知机能受损、人格精神障碍。基于2020年美国AD协会公布的事实与数据报告可知,2000至2018年因心脏病死亡的例数下降7.8%,因AD死亡的例数则上调了146%,全世界现有约7 000万至1亿早期阿AD患者,预计到2050年,将增至1.52亿以上。我国现有AD患者的数量超过1 000万[1]。据2020年发布的《中国阿尔茨海默病患者家庭生存状况调研报告》预测,随着我国老龄化的不断深入,预计到2050年中国AD患病人数将超过4 000万。到2020年为止,全国年龄≥65岁者的数量为1.91亿左右,为13.50%占比,而今后,此年龄群的人口数量的增幅会最高,同时为AD的高发群体[2]。但我国当前防治AD,存在诸多难题,包括公众认知度低、未研究出有效的药物疗法、患病率高且就诊率低、照护难度高、疾病压力大等。增强全社会的AD预防意识,探寻AD的早筛方法,推动预防关口前移,已经成为我国应对老龄化,应对AD的关键。

1 AD的病理机制

AD的病理机制目前尚不明晰,目前概括为神经退行性变化和炎性反应两部分。神经退行性变化涉及神经元变性、神经细胞凋亡、新生神经元的产生。炎性反应是指AD患者脑中的炎性反应,包括活化的细胞因子和炎性细胞因子的释放。此外,许多研究表明,AD的病理机制还受到蛋白质氧化应激的影响[1,2]。氧化应激是指细胞内缺氧或缺氧的情况下,自由基的产生和活性氧的增加,从而导致细胞结构和功能的破坏。研究发现,氧化应激可以影响AD患者脑中神经细胞的凋亡和变性,从而增加病变的严重程度[1]。有报道称AD还受到神经递质的影响,AD病患者大脑中的神经递质水平低于正常人,这可能是导致AD患者出现认知障碍的原因之一[2]。此外,AD患者大脑内有明显的淀粉样变性现象。淀粉样变性是指在AD患者大脑中出现的多种病理变化,其中包括淀粉样结晶、神经元的变性、神经细胞的凋亡等。而此类病变可能是AD的一项关键病因,同时为AD的诊断标志物。

2 AD生物标志物

因AD的病程的不可逆性,笔者发现截止当前尚未研究出有效的治疗方法与药物,所以,在治疗AD方面,早期诊断为其核心工作。近年来,研究人员对AD诊断标志物的研究取得了长足的进展,从而推动了该病的早期诊断和有效的治疗。在过去的几十年里,研究人员一直在研究AD诊断标志物,如神经影像学技术、生物化学技术、分子生物学技术等。神经影像学技术是目前最常用的AD诊断标志物,包括磁共振成像(MRI)、脑血流成像(CBF)、脑电图(EEG)等。它们都可以提供准确的诊断信息,从而帮助医生确定患者的病情。随着AD早筛诊断的迫切需要,人们将目光聚焦于采用生物标志物来特异性的诊断AD[1]。这些特异的生物标志物与 AD的病理表现和疾病的发生发展存在密切的关系,对AD的早期诊断以及预测从轻度认知障碍向AD进展及治疗效果等方面具有重要的意义。有研究者采用生物化学技术,如血清学和尿液分析,开展对AD的早期诊断[3]。血清学检查可以检测血清中的淀粉样蛋白(Aβ)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酸氨基转移酶(ALT)等。尿液分析也可以检测尿液中的Aβ。此外,分子生物学技术也被应用于AD的早期诊断。其中,聚合酶链反应(PCR)可以检测AD的遗传标志物,从而有助于早期诊断。目前也有研究人员利用基因组学技术,检测AD的基因突变,从而提供准确的诊断信息。

2.1 遗传学标志物 基于发病年龄,可将AD划分成早发性(发病时年龄<65岁)、晚发性(发病时年龄≥65岁);以存在家族史与否为依据,AD又存在家族性、散发性之分。在占比方面,早发性AD为5%左右,在早发性AD中,61.5%者为家族性AD。对于早发性AD而言,APP、PSEN1与PSEN2基因是其广泛认可的相关基因,80%左右的早发性家族性AD存在这3类基因的突变现象[2]。

载脂蛋白Eε4(APOEε4)是晚发性 AD十分明确的风险基因,可能会促使发病年龄提前,同时可加快认知减退的发展,目前已被认定为AD的一类遗传标志物[3]。ApoE为血浆脂蛋白一类关键构成部分,可生成β-淀粉样肽,对神经功能具维持作用。美国国家阿尔茨海默病协会在2011年发表的《美国国家阿尔茨海默病协会关于阿尔茨海默病引起的早期症状(轻度痴呆)的诊断标准》提出了ApoEε4等位基因是唯一被广泛接受的可以增加晚发性AD的风险遗传因素,而ε2等位基因降低患病风险。《中国痴呆与认知障碍诊治指南(2015年版)》指南中指出：ApoEε4是晚发型AD和散发型AD的风险因子,而且与年龄相关的认知能力下降有很大关联。ApoEε4基因型还是MCI(轻度认知功能障碍)或CIND(非痴呆性认知功能损害)演变为AD的风险因子。诊断推荐认为应测定ApoE基因型,可通过APOEε4基因分型测定来划分MCI患者的危险等级,评估其演变为AD的风险(B级推荐)。《中国阿尔茨海默病临床前期主观认知下降诊断流程与规范专家共识 》中SCD(主观认知下降)的诊断流程与规范中明确要进行ApoE基因检测,ApoE分子分型有助于发现SCD、MCI等AD 临床前期患者。因此ApoE基因分型检查的普及势必会将预防端口前移,延缓AD的发病甚至降低其发病率。我国目前只有5张ApoE基因分型试剂盒注册证,且仅少量临床及体检机构开展了关于ApoE基因分型的检测项目。

2.2 β-淀粉样蛋白 在水解淀粉样前体蛋白(APP)作用下,β-与γ-分泌酶可产生β-淀粉样蛋白(Aβ)。此类多肽在诸多细胞内皆有分布,同时可见于血液、脑脊液(CSF)与脑间质液内。Aβ最广泛的亚型是Aβ40、42,后者具备神经毒性,和AD的形成进行存在联系。其大部分生成自小胶质细胞与星形胶质细胞,存在疏水性特点,同时在斑块形成中起主要作用[4]。

通常认为CSF内的 Aβ42是 AD 的生物标志物,同时有助于诊断临床前期 AD。脑脊液中较低水平Aβ42与大脑中较高的Aβ斑块存在关联,与正常对照组相比,AD患者脑脊液中Aβ42的浓度水平显著降低[5]。目前,脑脊液中Aβ42的检测可以采用免疫技术或质谱法进行。但Aβ42检测AD的特异性有待提高,有研究显示可采用Aβ42/Aβ40的比值来判断疾病早期阶段大脑中的淀粉样蛋白沉积,这种方法的特异性显著优于单独测定Aβ42[6]。 然而脑脊液的检测是有创的,不利于早期的筛查,目前越来越多的学者开始探索血液的生物标志物。Aβ蛋白可在血浆中测量,但血浆中Aβ浓度会受到血小板等因素的影响[7],与AD的相关性不及脑脊液中的Aβ浓度[5]。但令人欣喜的是,研究表明,采用质谱方法检测血浆中Aβ浓度可呈现与脑淀粉样变性之间的显著相关性[8]。所以,挖掘有效性更高的测定技术,为突破血液筛查的核心。

2.3 Tau 微管系统为神经细胞骨架成分,其构成含微管蛋白(tubulin)与微管相关蛋白,后者含量较高的是 Tau蛋白。Tau蛋白的主要作用为结合微管蛋白,同时促进微管的产生[9], 若Tau过度磷酸化可聚集于细胞中,伤及微管机能,同时破坏神经细胞细胞骨架或轴突运输,由此引发神经元变性。通常认为总-tau(T-tau)和磷酸化-Tau(P-tau)浓度与AD相关。T-tau的升高反映了神经元和轴突的退化和损伤程度[10]。P-tau的高水平提示神经纤维缠结的形成[11]。

CSF P-tau被视为AD 最具特异性的标志物,AD患者CSF的P-tau浓度会显著增加。有研究显示P-tau 蛋白可用于判断MCI向AD的转化[12],因此可作为早期临床诊断的关键标志物。现今可通过ELISA等免疫手段,对CSF内P-tau水平展开测定。血液中P-tau的检测也是当前研究的热点,但与Aβ蛋白一样,血液筛查的技术还有待进一步提升,我国已批准六张“人磷酸化tau-181蛋白测试试剂盒”注册证,试剂盒用于检测血液中的P-tau的浓度,但仅能为临床诊断提供辅助依据。学者们也试图改进检测方法探寻提升血液筛查的准确性和灵敏度,有探究报道了可在血源性神经元衍生的外泌体中检测到 P-tau 浓度增加[13]。在该测定中,使用针对富含神经元的蛋白质的抗体从血清中分离外泌体。然后洗涤和裂解分离的外泌体,并使用免疫化学测定法测量它们的 tau 含量。尽管这是一项新技术,但是该技术在检测血液中P-tau方面具有很好的前景。

2.4 神经丝轻质多肽(NFL) NFL是由NEFL基因编码的肽,是一种内在的细胞骨架蛋白,可作为轴突损伤的生物标志物,在脑脊液和血浆中均可获得。脑间质和脑脊液中的神经元死亡后释放出NFL,随后进入血液[14]。NFL的血清或血浆水平与 CSF NFL 密切相关,在家族性和散发性 AD 中均表现为增加,其中在家族性 AD 中,患者在出现显著临床症状之前10年即表现为NFL的浓度升高[15]。因此,血浆或血清 NFL可能是 AD 和其他神经退行性疾病中神经退行性疾病的可靠血液生物标志物。

2.5 血浆胶质纤维酸性蛋白(GFAP) GFAP是一类用于星状胶质细胞活力监测的关键指标。以往的研究表明, GFAP在 AD 患者脑内[16]和 CSF[17]中均有明显增加,提示 GFAP有可能成为AD的潜在生物标志物。Oeckl等[18]的研究显示,AD患者血清 GFAP含量较正常对照组明显偏高。此外有报道也提示,与正常对照组相比早发性AD患者血浆浓度明显增高,而晚发性 AD患者血浆中GFAP浓度的增加虽然没有早发性AD显著,但也明显高于正常对照组[19]。因此GFAP有望成为血液AD标志物的一员,为 AD的临床诊断提供新的线索。

2.6 神经颗粒蛋白(Neurogranin,Ng) Ng也是AD早期诊断的潜在生物标志物,通常在海马和皮质的锥体细胞中以颗粒状结构表达。Ng被证明与钙/钙调蛋白信号通路介导的突触可塑性、突触再生等功能有关[20]。有学者比较了AD、额颞叶痴呆、路易体痴呆、帕金森病等患者的脑脊液中神经颗粒蛋白的水平,结果表明,AD患者脑脊液中的神经颗粒素浓度显著高于其他疾病,进一步说明脑脊液中较高的Ng蛋白浓度对AD具有特异的筛查作用[21]。

2.7 联合筛查 目前普遍认为,单一的标志物不能满足AD的早筛、早诊要求,建立AD诊断的标志物组能更全面的反应AD的病程。有研究表明在 CSF中P-tau与 Aβ42的联合使用可提高早期AD检测的敏感性和特异性,P-tau与T-tau结合能较好地反映出 AD的发展过程[22],而T-tau/Aβ比率是预测 MCI向 AD转变的最为可靠的生物指标[23]。T-tau和淀粉样蛋白在 AD的诊断中具有一定的应用价值,但在 AD的鉴别中缺少特异性。在预测 MCI演变为AD的方面,P-tau蛋白发挥着重要作用。P-tau、T-tau、Aβ42在AD的早期诊断中发挥着不同的作用,但联合使用3种标志物会显著提高AD的早期诊断的准确性,更好的预测MCI向 AD的阶段,有利于预防和早期筛查[24]。此外,NFL、GFAP、Ng等不断发现的新的标志物也应加入到AD的标志物组中,建立完善的标志物组合,才能有效推动AD的早期诊断。

3 潜在的生物标志物

3.1 炎性因子 AD 的潜在生物标志物除了可用于标志神经退行性病变。AD中的全身性炎症可能会加剧神经功能缺损,炎性分子可促进血脑屏障的通透性,近几年有关AD患者外周炎性因子浓度变化的研究也成为另一热点,其中AD患者外周血中IL-1家族细胞因子浓度大多升高[25]。与正常对照组相比,AD 患者CCL2 蛋白在血清和脑脊液中也呈现升高的趋势[26]。AD 患者的血清与CSF存在相关趋化因子(诸如CXCL8、CXCL9等)水平上调表现[27]。

3.2 代谢组学 随着核磁共振和质谱的快速发展以及高效液相/气相色谱技术的成熟,目前已实现对数千种代谢物进行动态评估,反映基因组、转录组和蛋白质组下游变化的功能网络。Greenberg 等[28]报道了血浆中的代谢变化,证明了AD患者中甘油磷酸胆碱和d-氨基葡萄糖与对照组存在显著差异。Oreeim等[29]对比了2年内从MCI进展为AD以及未进展为AD的人群的代谢物表达情况,可显著观察到2组人群存在代谢物的表达差异,特别是由 2,4-二羟基丁酸驱动的代谢物。Trushina 与Mielke经由研究发现,在β-丙氨酸(Ala)、胆汁酸(BA)、天冬氨酸(Asp)与天冬酰胺、赖氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、L-精氨酸(Lys)、L-半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)-Cys-谷氨酸(Glu)、L-Met的生物合成与代谢方面,对照组与AD有显著不同[30]。此外心血管疾病和 AD 之间也存在一定的关联性[31],血脂评估已成为寻找基于血液的 AD生物标志物的另一个热门领域。

3.3 miRNA miRNAs,即MicroRNAs,属于内源性单链非编码小分子RNA,作用为调节基因表达。目前认为 miRNA 可在脂质体、高密度脂蛋白(HDL)、外泌体和一些蛋白质中进行运输,保护 miRNA 不被降解。Leidinger等[32]报道了一组共12种miRNA,能够以 93% 的准确度将 AD 与对照区分开来。同时这组miRNA可以有效区分AD患者与MCI、多发性硬化症、帕金森症、重度抑郁症、精神分裂症和双相情感障碍患者,其准确率为74%～78%[33]。Nagaraj 等[34]最近对作为 AD 生物标志物的miRNA 进行了回顾,他们在文献中报告了 136种miRNA 在 AD 和对照状态之间发生显着变化。在这136种 miRNA 中,有36 种经过独立验证并在两个或更多个文献中被报道,其中 hsa-miR-125b被6次证明与AD相关。

3.4 外泌体 外泌体为脑中各类细胞(含星形胶质细胞、神经元与小胶质细胞)产生的一类细胞外囊泡(EV),在不同细胞的通讯方面发挥关键作用。在中枢神经系统(CNS)中,外泌体不仅在细胞内的短距离范围内传播信号,而且还通过脑脊液(CSF)在整个大脑中传播,甚至还可穿越血脑屏障在外周血中进行检测[35]。多项研究表明血液中星形胶质细胞外泌体可作为AD早期诊断的生物标志物[36]。AD 患者血浆神经元外泌体中p-S396-tau、p-T181-tau 和 Aβ42 的水平显着高于对照组,与CSF 中的浓度存在相关性[13]。因此,通过检测外泌体中Aβ42、T-tau 和P-tau用于早期AD的诊断而非有创的CSF检测成为可能。

3.5 甲酸 Wang等[37]测试了一大批患有不同严重程度AD的患者和认知能力正常的健康对照组,以确定尿液生物标志物的差异,研究发现,与健康对照组(包括早期 SCD 组)相比,所有AD患者的尿甲酸水平都显著升高,并与认知能力下降相关。如此可见甲酸作为早期AD的生物标志物具敏感性。当研究人员结合基于血液的AD生物标志物分析尿液中的甲酸水平时,发现它们可以更准确地预测患者所处的疾病阶段。因此甲酸有望成为新的诊断标志物。

3.6 凝溶胶蛋白(gelsolin) Jiang等[38]研究认为GSN为AD的风险基因,研究人员利用全基因组测序在AD病例-对照队列(1 192例AD患者和1403例对照)中进行罕见变异分析,发现GSN基因移码突变在AD患者(0.50%,6/1 192)中占比较高;随后在验证队列中进行GSN靶向测序,发现AD患者中GSN移码突变频率高达1.47%。GSN基因编码凝溶胶蛋白(gelsolin),是一种钙调控的肌动蛋白调节蛋白,参与炎症、细胞活性、凋亡和癌症发生等多个生理过程。为明确携带GSN移码突变患者的临床诊断,团队对部分患者完成了Aβ-PET、皮肤活检等检测,证实了携带GSN移码突变患者为AD表型,认为GSN为AD新的风险基因。进一步的研究表明,GSN移码突变可降低Aβ42水平、抑制Aβ诱导毒性和保护细胞凋亡的功能丧失。为进一步探索gelsolin能否作为AD早期诊断标志物,团队还发现AD患者血浆和脑脊液中gelsolin水平显著高于对照,与脑脊液中Aβ42水平呈正相关;且gelsolin蛋白水平随病程和认知功能下降呈先升高后降低的趋势,提示血浆gelsolin蛋白的升高可能是AD的代偿反应,有望成为AD新的生物标志物。

AD在老年群体中的患病人数逐年攀升。在我国≥65岁老年人中,每20人中就有1人患AD,≥85岁的4位老人就有1人患病[1]。AD属于一类进行性慢性神经退行性病变,表现以记忆力下降、行为异常、思维能力减退等为主。由于AD的慢性进行性特点,一旦发病,患者的生活质量将极大降低,也给家庭带来很大的负担。所以,早期诊治AD非常关键。生物标志物目前认为是可以作为AD早期诊断的重要手段,如通过分析PSEN1、PSEN2、APP、APOE等基因的突变和基因分型的情况,预测分析AD的病程。脑脊液Aβ1-42、T-tau 和 p-tau的浓度对AD的诊断具有重要的意义,然而脑脊液采样方法的侵入性限制了其在临床实践中的传播和应用。与脑脊液标记物相比,血液标志物获取容易,创伤小,操作简单等优势则更适合AD的早期筛查和诊断。但目前仍没有十分理想的AD标志物,学者们开始探寻新的出路,想通过炎性因子、代谢组学、miRNA、外泌体等多种途径找到最合适的生物标志物。随着研究的逐渐深入,学者们也普遍认为,建立AD的标志物组来进行联合诊断的方式才能有效追踪AD的发生发展过程。未来如何建立合适的标志物组合将会成为AD早期筛查的研究热点,只有突破这一技术壁垒才有望实现早诊断、早预防、早治疗、最大程度的降低疾病造成的损害。