产气柯林斯菌联合丁酸梭菌干预局灶性缺血性脑卒中小鼠的实验研究

徐晓松,蔡祥胜,周 辉,李瑞莹,陈小明,官煜彬

缺血性脑卒中是由于脑部血管发生暂时或永久性阻塞从而引发的组织损伤,具有致残率高及致死率高的特点,缺血性脑卒中的发生与高血压、糖尿病、心脏病、肥胖、血脂异常、代谢异常等因素有关[1-4]。脑梗死体积大小和神经系统功能受损程度与疾病发生后侧支血流循环的建立、血压灌注及药物的使用密切相关。目前,缺血性脑卒中的治疗手段主要以组织型纤溶酶原激活物溶栓为主,其中药物治疗以改善脑部血循环的抗血栓药物及脑神经保护药物为主[5-6]。但是,使用抗凝药时,要充分考虑药物之间的相互作用及其疗效等,而脑神经保护药物的疗效及安全性也有待进一步的观察与研究[6]。脑卒中后可引起肠道菌群失调,而肠道菌群的失调又可影响脑卒中的预后,研究表明,脑卒中发生前后相关生化指标浓度会发生变化[7-8]。改变肠道菌群结构特征可改善病人生理功能,延缓疾病进展[9]。因此,本研究拟通过建立局灶性缺血性脑卒中小鼠模型,观察经产气柯林斯菌及丁酸梭菌联合干预后,小鼠神经行为学、脑卒中后脑组织梗死体积及相关炎性指标的变化,探讨该特定菌群对缺血性脑卒中的疗效。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组 无特定病原体(SPF)级8～10周龄C57BL/6J雄性小鼠48只,购自珠海百试通生物科技有限公司[生产许可证号:SCXK(粤)2020-0051]。所有小鼠均在 SPF 级动物房中分笼适应性饲养1 周,室温(24±2)℃,每12 h昼夜交替,自由饮水进食。随机分为对照组(12只)、生理盐水组(9只)、产气柯林斯菌悬液组(9只)、丁酸梭菌悬液组(9只)、混合菌悬液组(9只),生理盐水组、产气柯林斯菌悬液组、丁酸梭菌悬液组、混合菌悬液组每日分别给予生理盐水、产气柯林斯菌悬液、丁酸梭菌悬液、混合菌悬液灌胃1次,灌胃容积为10 g(0.1～0.2 mL),最大容积不超过0.8 mL。

1.1.2 实验仪器及试剂 生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司,BSC-1304ⅡB2)、低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司,海尔DW-25L262)、灌胃器(自制)、小鼠实验模型造模呼吸机(卡尔文公司,KW-10)、麻醉机(Matrx,7025)等。小鼠白细胞介素(IL)-1β、IL-6检测试剂盒(合肥莱尔生物科技有限公司),无菌生理盐水(购自石家庄四药有限公司),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液(Sigma公司)等。

1.1.3 实验菌种获取及配制 将缺血性脑卒中病人粪便进行厌氧培养,筛选后进行多次增菌培养,获得产气柯林斯菌和丁酸梭菌并留取菌种备用,分别将产气柯林斯菌菌悬液和丁酸梭菌菌悬液按1∶1混合配制成含菌个数约为1×1010菌落形成单位(cfu)/mL的混合菌悬液。

1.2 实验动物模型制备 采用吸入异氟烷诱导麻醉的方法对小鼠进行麻醉处理。采用颈外动脉插线法建立局灶性缺血性脑卒中小鼠模型[10],小鼠缺血2 h后抽出线栓形成脑部血管再灌注,期间保持小鼠肛温为(37.0±0.5)℃。

1.3 实验方法

1.3.1 IL-1β、IL-6检测 采用尾尖取血法采集各组小鼠建模成功后2 h、1周、2周0.3 mL血后离心,检测IL-1β、IL-6浓度。

1.3.2 神经行为学评分及模型成功判定标准 对建模成功后2 h、1周、2周,根据Longa神经行为学评分标准对相应模型进行美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分。Longa神经行为学评分标准如下:无神经功能损伤,小鼠表现正常计0分;提尾时,小鼠右前肢屈曲,伸直不完全计1分;小鼠向对侧转圈计2分;小鼠向右侧倾倒计3分;小鼠不能自发行走,意识丧失计4分。1～3分表明造模成功。

1.3.3 脑卒中病灶体积测定 在上述相应实验时间段处死实验小鼠(对照组每次处死4只,其他各组每次处死3只)并取新鲜脑组织,低温冰冻后行冠状面连续切片并进行TTC染色,采用Image J软件测定脑卒中病灶体积。

2 结 果

2.1 各组小鼠NIHSS评分比较 与对照组及生理盐水组比较,产气柯林斯菌悬液组、丁酸梭菌悬液组、混合菌悬液组建模成功后2周NIHSS评分降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组小鼠NIHSS评分比较(±s) 单位:分

2.2 各组小鼠IL-1β、IL-6比较 与对照组及生理盐水组比较,产气柯林斯菌悬液组、丁酸梭菌悬液组、混合菌悬液组建模成功后2周L-1β、IL-6降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组小鼠IL-1β、IL-6水平比较(±s) 单位:pg/mL

2.3 各组小鼠脑卒中病灶体积比较 与对照组及生理盐水组比较,在建模成功后1周,混合菌悬液组小鼠脑卒中病灶体积已开始减少(P<0.05);建模成功后2周,产气柯林斯菌悬液组、丁酸梭菌悬液组、混合菌悬液组小鼠相对脑卒中病灶体积减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图1～图3及表3。

表3 各组小鼠脑卒中病灶体积比较(±s) 单位:%

图1 各组小鼠建模成功后2 H脑组织TTC染色图(白色为脑缺血组织,红色为正常脑组织)

图2 各组小鼠建模成功后1周脑组织TTC染色图(白色为脑缺血组织,红色为正常脑组织)

图3 各组小鼠建模成功后2周脑组织TTC染色图(白色为脑缺血组织,红色为正常脑组织)

2.4 各组小鼠不同时间点脑组织相对缺血体积与非缺血体积百分比比较 与建模成功后2 h比较,建模成功后1周,各组小鼠脑组织相对缺血体积均发生了增大的趋势,且差异有统计学意义(P<0.05);建模成功后2周,产气柯林斯菌悬液组、丁酸梭菌悬液组、混合菌悬液组小鼠脑组织相对缺血体积降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图4。

图4 各组小鼠脑组织相对缺血体积与非缺血体积百分比直方图

2.5 IL-1β、IL-6与小鼠脑卒中病灶体积的相关性 IL-1β、IL-6与小鼠脑卒中病灶体积呈正相关。详见图5、图6。

图5 IL-1β与小鼠脑卒中病灶体积相关性的散点图

图6 IL-6与小鼠脑卒中病灶体积相关性的散点图

3 讨 论

研究显示,益生菌活菌制剂联合肠内营养可提升重症脑卒中病人的治疗效果、调节菌群平衡、降低不良反应发生率,具有较高的临床应用价值[11]。Liu等[12]采用灌胃的方法将多形拟杆菌移植到小鼠肠道内,发现小鼠的体重发生了变化,同时代谢途径及机体炎症状态得到显著改善。肠道微生物群中的丁酸梭菌可减少中枢神经功能损伤[13]。柯林斯菌为代谢产物,与中枢神经及免疫系统显著相关,可增强机体的抗氧化能力[14]。本研究结果显示,与对照组及生理盐水组比较,建模成功后2周,产气柯林斯菌悬液组、丁酸梭菌悬液组、混合菌悬液组NIHSS评分降低,差异均有统计学意义(P<0.05),表明产气柯林斯菌及丁酸梭菌单独或联合干预一定时间后均可对局灶性缺血性脑卒中小鼠的神经功能起保护作用。

局灶性缺血性脑卒中是由于小鼠脑组织缺血、缺氧及缺血再灌注损伤导致相关区域神经组织细胞的部分死亡,从而表现出脑神经损伤及神经功能缺失等症状[15]。研究显示,丁酸梭菌可通过激活与细胞生长、凋亡密切相关的蛋白激酶B(AKT)通路,降低促凋亡相关蛋白含量及提高抗凋亡相关蛋白浓度,具有保护脑部神经组织细胞、减轻脑组织损伤的作用[16]。在一项动物研究中,经过相关药物有效治疗后的大鼠肠道中的短链脂肪酸(SCFA)产生菌-产气柯林斯菌的比例明显升高,且炎症显著改善[17]。SCFA是肠道细菌发酵纤维素产生的溶于水的游离脂肪酸,主要包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸[18]。研究表明,SCFA产生菌可减轻缺血性脑卒中小鼠脑卒中后的神经功能障碍和炎症,同时也可提高肠道、大脑和血浆中的SCFA浓度[19]。本研究结果显示,与对照组比较,混合菌悬液组小鼠无论是在建模成功后1周或2周的时间点上,脑卒中病灶体积增大趋势均明显减缓(P<0.05),而产气柯林斯菌组及丁酸梭菌组建模成功后1周脑卒中病灶体积增大趋势暂未发现有明显减缓趋势(P>0.05)。

进一步分析各组小鼠的脑卒中病灶体积百分比,相较于建模成功后2 h,在建模成功后1周,各组小鼠脑卒中病灶体积均增大(P<0.05),但在建模成功后2周,与相应的建模成功后1周比较,各组小鼠脑卒中病灶体积缩小(P<0.05)。动物研究表明,缺血脑卒中大鼠缺血再灌注后第7天梗死灶体积最严重,第14天梗死灶有自发缩小趋势[20],这与本研究结果基本一致。然而,本研究发现,与对照组比较,产气柯林斯菌悬液组、丁酸梭菌悬液组、混合菌悬液组建模成功后2周小鼠脑卒中病灶体积明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),但对照组和生理盐水组比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究表明,产气柯林斯菌及丁酸梭菌联合干预对局灶性缺血性脑卒中小鼠的脑部神经组织损伤具有一定的保护作用。

宿主的免疫炎性因子与肠道菌群结构特征相关,IL-1β、IL-6等相关因子具有神经保护作用,且与缺血性脑卒中的脑损伤程度相关[21-22]。丁酸梭菌可通过其代谢产物SCFA改善宿主的肠道通透性,减少炎性因子IL-1β及IL-6的分泌从而发挥抗炎、抗氧化的作用[23]。另有研究指出,柯林斯菌属可通过其代谢产物促进宿主体内的酶合成脱氧熊胆酸,从而提高宿主物质及能量代谢,发挥抗炎、抗氧化的作用[24]。减少缺血性脑卒中病人炎性因子IL-1β、IL-6的分泌,可改善病人的预后[25]。本研究结果显示,混合菌悬液组在混合菌悬液干预2周后,与对照组、生理盐水组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),且IL-1β、IL-6水平与小鼠脑卒中病灶体积呈正相关。

综上所述,本研究结果表明,产气柯林斯菌及丁酸梭菌联合干预2周后,对保护局灶性缺血性脑卒中小鼠的神经功能、缓解小鼠脑部炎症、减小小鼠脑卒中病灶体积均具有一定的作用。