IL-33和炎症细胞因子在结肠腺癌中的表达及相关性

段芷颖，陈火英，雷可，陈小红，史悦娇，夏承明，孙燕

1.中南民族大学生命科学学院，湖北 武汉 430074；2.桂林医学院第二附属医院检验科，广西 桂林 541004；3.武汉市第三医院，湖北 武汉 430000

结肠癌是严重危害人类健康的消化道恶性肿瘤，发病率占胃肠道肿瘤的第三位，其死亡率仅次于肺癌[1-3]。结肠癌主要分为腺癌、黏液腺癌和未分化癌，大体形态呈息肉状、溃疡型。结肠腺癌(colon adenocarcinoma，COAD)是结肠腺上皮来源的常见消化道恶性肿瘤，是结肠癌多种病理类型中最常见的一种[4]。慢性炎症性肠炎患者、结肠息肉患者和肥胖者是COAD 易感人群，因生活方式如高脂饮食改变人类肠道的菌群结构，其发病率呈逐年上升趋势。因此，开发早期检测和新的治疗方法，对于有效的疾病管理和提高COAD患者生存质量、生存率是非常必要的[5]。

白细胞介素33(interleukin 33，IL-33)是IL-1细胞因子家族的新成员，作为双功能因子，不仅具有核转录因子活性，而且具有细胞因子活性，通常驻留在它所表达细胞的细胞核中[6]。当它作为细胞因子时，发挥炎症细胞因子的作用并参与免疫应答过程，在炎症性疾病中促进Th2免疫反应。已有研究报道，IL-33在多种恶性肿瘤中发挥促进炎症和抑制炎症的双重作用[7-8]。胃癌、肝癌和非小细胞肺癌患者血清中IL-33的水平升高、肿瘤组织病灶区IL-33的表达异常，参与癌症的发生、发展和转移，与疾病预后不良相关[9-11]。因此，选择性抑制IL-33 过度表达而保留正常的细胞核表达IL-33成为靶向肿瘤治疗研究的新目标。虽然IL-33在肿瘤免疫中的作用已被广泛研究，但IL-33在COAD发生、发展中的作用有待进一步探究。

本文以COAD为实验对象，利用人类蛋白质图谱数据库(Human Protein Atlas，HPA)进行数据挖掘，分析COAD结肠组织IL-33和炎症相关的细胞因子的表达，以及分析IL-33 与炎症细胞因子的相关性。预测IL-33 在COAD 中的作用，从而以IL-33 为靶点防治COAD的机制研究与临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料来源 利用TIMER 2.0 数据库(http://timer.cistrome.org)对COAD炎症细胞因子进行初步筛选，利用HPA数据库(https://www.proteinatlas.org)检索并分析15 名健康人和47 例COAD 患者结肠组织IL-33和炎症细胞因子的蛋白表达水平以及相关性。

1.2 方法

1.2.1 筛选炎症细胞因子 TIMER (Tumor Immune Estimation Resource)数据库是类似于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)的一个肿瘤免疫在线研究工具，主要研究免疫浸润与遗传或临床特征之间的关联。进入TIMER 2.0 数据库，选择检索选项“Exploration”，画面显示4 个目标检索方式，选择“Gene DE”检索肿瘤患者与健康人之间的差异基因表达，输入关键词，例如“IL-33”，系统将自动弹出该数据库收录的差异基因类型，选择目标搜索基因，点击“Submit”即加载出IL-33 在各类肿瘤患者和正常人体内的表达，使用箱线图显示基因表达水平的分布。

1.2.2 检索癌变结肠组织中炎症细胞因子的表达免疫组化图谱 蛋白质在组织、细胞或亚细胞水平的准确定位与蛋白质功能密切相关，为了全面系统性解析蛋白质在疾病中的作用，有必要对蛋白质表达进行空间分辨率的研究。HPA 数据库致力于提供人体内24 000 种蛋白质的相关信息，包括人体组织、血液、细胞和大脑中的分布信息，以及病理状态下免疫组织化学染色图等信息，产生了超过1 000 万张显示单细胞水平的蛋白质表达模式的图像，并共享于www.proteinatlas.org。HPA 数据库核心是收集独特的抗体，通过免疫组织化学和免疫细胞化学绘制整个人类蛋白质组图谱，目前呈现每种蛋白质在48 种人体正常组织、20 种肿瘤组织、47 个细胞系和12 种血液细胞内的分布和表达。目前HPA 数据库分为六个主要部分：(1)显示蛋白质在人体所有主要组织和器官中分布的组织图谱；(2)显示蛋白质在单个细胞中的亚细胞定位的细胞图谱；(3)显示蛋白质水平对癌症患者生存影响的病理学图谱；(4)显示血细胞和主动分泌蛋白质表达谱的血液图谱；(5)显示蛋白质在人、小鼠和猪脑部的分布图谱；(6)显示蛋白质参与人体代谢的代谢图谱。使用HPA 数据库共纳入62 例结肠组织免疫组化染色病理图(表1)。首先，进入HPA 数据库，在“SEARCH”检索框中输入关键词“IL-33”，将显示IL-33 在Tissue(人体组织)、Pathology(病理组织)和Cell(细胞)中的表达图谱，而在Cell type(细胞系)、Brain(大脑)和Blood(血液)中则未收录明确数据。然后，点击“Tissue”，选择画面左侧“TISSUES”并选择“COLON”，即进一步检索IL-33 在人体结肠组织中的表达。例如在“COLON-Antibody staining”中 包 括“HPA024426”和“CAB007057”两种抗体对正常结肠组织进行免疫组化染色图，并说明IL-33 在结肠内皮细胞(endothelialcells)、腺细胞(glandular cells)、外周神经/神经节(peripheral nerve/ganglion)中的表达程度。最后，任意点击一张免疫组化染色病理图即获取图源信息，记录样本ID编号和免疫组化染色抗体名称。

表1 样本数据信息Table 1 Information on sample data

1.3 观察指标与评价方法 采用双盲法对结肠组织免疫组化染色病理图进行量化分析，在双盲试验中，实验者和参与者只有在所有数据被记录完毕后才能对样本的所属组别知情。将提取出的62 个免疫组化图随机排列，隐藏所有图源信息，交由实验者和参与者进行识别和记录。在控制抗体类型一致的情况下，判断阴性细胞和阳性细胞，其阳性细胞表达呈现深棕着色，记录其阳性细胞的个数，取两组数据的平均值进行统计学分析。

1.4 统计学方法 GraphPad Prism 8.0 软件统计学分析并作图。计量资料以均值±标准误(±s)表示，两组资料间比较采用Two-tailed Student's-t 检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TIMER 2.0 数据库预测COAD 炎症细胞因子 通过TIMER 2.0数据库对COAD炎症细胞因子进行初步筛选，结果提示IL-33、TNF、IL-4、IL-6 和TGF-β1等细胞因子可能通过多靶点协同作用于COAD，见图1。

图1 TIMER 2.0数据库筛选炎症细胞因子Figure 1 TIMER 2.0 database screens for inflammatory cytokines

2.2 COAD结肠组织IL-33、TNF、IL-4和IL-6阳性细胞表达分布 通过免疫组织化学染色和苏本素复染法，分别对HPA数据库来源的健康人和COAD结肠组织切片炎症细胞因子的表达进行观察，染色病理图呈现棕黄色颗粒即阳性细胞。结果显示：在结肠组织中炎症细胞因子IL-33、TNF、IL-4、IL-6 和TGF-β1均有表达，主要表达于黏膜上皮细胞(图2A1~J1；图2A2~J2是图2A1~J1局部放大图片)。如图2A1~D1所示，杯状细胞呈上大小下之形状，形似高脚杯，呈空泡状，Normal 组杯状细胞几乎不表达IL-33 和TNF，而COAD 组黏膜上皮细胞显著性的表达IL-33 和TNF。如图2E1~F1 所示，IL-4 阳性细胞主要分布于黏膜上皮细胞，与Normal 组相比较，COAD 组结肠黏膜上皮细胞表达IL-4阳性细胞数量较少，未见结肠“隐窝”结构和杯状细胞，且边缘较为模糊。如图2 G1~H1 所示，结肠黏膜上有很多“隐窝”结构，形似“小花”浅色花瓣是分泌碱性黏液的杯状细胞，Normal组结肠IL-6阳性细胞几乎表达在“小花”周围的黏膜上皮细胞中(图2G1)，与Normal 组相比较，COAD 组IL-6 阳性细胞的表达减少(图2H1)。此外，如图2 I1~J1 所示，TGF-β1阳性细胞主要表达在结肠黏膜上皮细胞，且TGF-β1阳性细胞表达量较少。

图2 COAD结肠组织IL-33、TNF、IL-4、IL-6和TGF-β1的表达分布图Figure 2 Distribution of IL-33,TNF,IL-4,IL-6,and TGF-β1 expression in colon tissues of COAD

2.3 COAD 结肠组织IL-33、IL-4 和TNF 的表达及其相关性 IL-33 作为一种炎症细胞因子，其在消化道炎症中表达升高，参与调节肠道免疫、肠道菌群、肠上皮细胞损伤等。通过HPA 数据库中提取出相应条件下的所有样本，导出HPA024426抗体检测COAD结肠组织中IL-33阳性细胞表达情况，并对IL-33阳性细胞进行细胞计数分析发现，IL-33 在COAD 中的表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)(图3A)。TNF 是主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，参与调节炎症反应和免疫应答。如图3B所示，COAD结肠组织TNF 的表达升高，结肠组织IL-4 和IL-6 的表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)(图3C 和图3D)，此结果与TIMER 2.0 数据库预测COAD 血清IL-4 和IL-6的水平升高相反。TGF-β1是一种转化生长因子，在炎症、组织修复、胚胎发育和免疫调节发挥着重要的作用，如图3E所示，与对照组相比，COAD结肠组织TGF-β1的表达整体趋势升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，推测这可能是因在不同状态人体结肠组织中TGF-β1的表达差异性不明显，有待进一步数据库挖掘和实验研究。此外，对COAD 结肠组织中IL-33与炎症细胞因子TNF、IL-4、IL-6 和TGF-β1进行了相关性分析，结果发现IL-33 与TNF 的表达呈正相关性(图3F)，而IL-33 与IL-4、IL-6 和TGF-β1的表达无相关性(图3G~图3I)，表明IL-33参与调控COAD炎症反应病变区分泌促炎症细胞因子TNF。

图3 COAD结肠组织中IL-33和炎症细胞因子的表达及相关性分析Figure 3 Expression and correlation of IL-33 and inflammatory cytokines in COAD colon tissues

3 讨论

炎症在肿瘤的发生、发展中起着关键性作用，近20年的流行病学、遗传学和药理学方法的研究数据表明，炎症促进肿瘤增殖和转移。在肿瘤的临床治疗中，使用抗炎药可以改善肿瘤患者的预后状态，减少手术后伤口炎症和感染，促进伤口愈合和降低癌症转移和复发风险。炎症反应在COAD的发生、发展中起着重要作用，炎症相关的细胞因子指标与COAD患者的生存预后密切相关，但炎症影响COAD患者病程的内在因素分子机制仍未阐明。肠道细胞因子网络不仅是炎症和组织平衡的关键媒介，而且影响COAD各阶段的致癌性，而炎症细胞因子失衡是炎症性肠病发病的主要原因。

在寻找可能与肿瘤炎症发病机制有关的生物标志物时，新的证据指向IL-1家族新成员IL-33，它既是一种双重功能的细胞因子，又是一种具有调控转录功能的细胞核因子，组成性表达在胃肠道、皮肤和肺等屏障组织细胞中，IL-33在炎症反应和肿瘤的发生、发展及预后方面发挥着重要作用[12-13]。IL-33是多种炎症性疾病的潜在介质，近年来成为研究肿瘤炎症机制和治疗靶点的新热点。炎症是IL-33释放的主要因素之一，在不同类型的肿瘤中IL-33的表达水平对肿瘤病程的影响呈现明显的差异性，多数肿瘤患者IL-33的表达水平显著升高，并与肿瘤发生、发展呈正相关性[14]，IL-33可进一步诱发肿瘤的发展浸润和转移。相关的研究表明，结直肠癌患者肿瘤组织中IL-33的表达水平显著高于正常组织，结肠癌患者外周血中IL-33的水平明显升高，且与结肠癌病情程度显著相关[15]。炎症相关的细胞因子如TNF-α、IL-4和IL-6等在结肠癌病程中发挥作用，表明IL-33和炎症细胞因子对结肠癌患者的预后具有密切联系。此外，IL-33 还可以抑制细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制结肠癌细胞的生长[16]。

肿瘤微环境与机体免疫系统Th1/Th2极化有关，肿瘤细胞的分化可抑制Th1型细胞因子的分泌、促进Th2型细胞因子的生成，导致Th1/Th2 失衡和免疫逃逸。Th1 型细胞因子主要有TNF-α、IFN-γ、IL-2 和IL-12等，Th2 型细胞因子主要有IL-4、IL-5、IL-6 和IL-10等。蛋白质的正确空间分布对其功能至关重要，而异位表达、过量表达、点突变和片段缺失往往会导致人类疾病的发生。HPA数据库已经成为研究人员研究人类组织和细胞中蛋白质定位和表达的宝贵工具。为了进一步探究IL-33和炎症细胞因子引发COAD的免疫学机制，本研究利用TIMER2.0数据库和HPA数据库，聚焦于COAD 中结肠部位的IL-33 和炎症细胞因子(TNF、IL-4、IL-6和TGF-β1)的表达和相关性分析。通过数据筛选和比对，对COAD结肠组织免疫组化病理图进行量化统计，分析得出COAD 结肠组织IL-33 和TNF的表达升高，IL-4和IL-6的表达降低，同时COAD结肠组织IL-33与TNF的表达呈正相关性。

IL-33和炎症细胞因子在COAD结肠组织中表达的差异性可为进一步研究结肠炎症和结肠癌的临床治疗提供理论基础。炎症反应会增加罹患结肠癌的风险，是否在食用者能承受住应激的情况下，通过调节膳食中IL-33等炎症细胞因子的水平降低结肠癌的发病率，还有待后期进一步探究。