细胞焦亡与铁死亡在口腔癌治疗中的研究进展

洪浩 综述 王帅 审校

1.遵义医科大学附属口腔医院口腔种植科，贵州 遵义 563000；2.遵义医科大学口腔医学院，贵州 遵义 563000；3.遵义医科大学附属口腔医院科研科，贵州 遵义 563000

口腔癌(OSCC)又称口腔鳞状细胞癌，是指发生在嘴唇、硬腭、上下牙槽嵴、舌前2/3、舌下区、颊黏膜、磨牙后三角和口底等区域的恶性肿瘤[1]。根据世界卫生组织《全球癌症观察(GLOBOCAN)》统计，2020年全球口腔癌新增病例已达377 713 例，新增死亡病例已达177 757 例，占全球癌症新增病例和新增死亡病例的2%和1.8%[2]。一直以来，手术和放射治疗因为存活率较高成为口腔癌患者的主要治疗手段。但是两种疗法的副作用和后遗症也会极大地降低患者的生活质量[3]。同时口腔癌细胞极易对多种化疗药物产生耐药性，无法显著提高患者的存活率或生活质量[4-5]。近年来，免疫疗法成为新兴的研究热点，然而较窄的抗癌谱和自身免疫引起的潜在毒性仍然是免疫治疗在临床上大规模应用的主要障碍[6-7]。因此许多研究者仍然尝试利用其他途径研发适用于口腔癌的治疗方法，尝试为癌症治疗开辟新的前景。

铁死亡和细胞焦亡是近年来公认的一类受调节的细胞死亡形式。不同于传统的细胞凋亡、坏死和自噬，细胞焦亡是一种由Caspase-1 介导的程序性细胞死亡程序，也称为细胞炎性坏死，而细胞铁死亡则涉及铁离子的积累和脂质过氧化等过程[8-10]。近年来有研究提示CD8+T 细胞及其衍生的γ-干扰素可以同时激发肿瘤细胞的焦亡和铁死亡机制，共同造成细胞膜穿孔的现象，表明两者不仅在宏观上与肿瘤的发生和发展过程密切相关，同时在微观上两者有着相似的功能和高度的关联性[11-12]。若能在口腔癌细胞中探明这两种机制，则不仅可以有效抑制癌症的演进，同时有助于针对这两种机制设计诊断、治疗和预后策略。为此，本文针对细胞焦亡和铁死亡在口腔癌中的研究现状和未来展望综述如下：

1 口腔癌细胞铁死亡

铁是人体不可缺少的微量元素，在细胞新陈代谢、生长和发育过程中发挥着关键作用。同时铁离子在肿瘤的生长过程中具有双重特性，正常情况下癌细胞对铁的依赖性增加，巨噬细胞则将铁传递给癌细胞，从而促进肿瘤生长[13]。但是过度提高铁离子的浓度则会诱导癌细胞的铁死亡。除了细胞内需要维持一定的铁离子浓度以外，细胞内活性氧(ROS)水平和脂质过氧化积累共同构成了影响肿瘤细胞铁死亡的关键因素[14]。在此过程中，胱氨酸通过由溶质载体家族7 成员11 蛋白(SLC7A11)和蛋白SLC3A2 组成的胱氨酸/谷氨酸转运受体交换进入细胞内，并还原成半胱氨酸参与细胞内自由基清除剂谷胱甘肽(GSH)的合成，而GSH 也是谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)的辅助因子[15]。若胱氨酸的转运或GPX4 的合成出现干扰，则细胞体内的活性氧水平将快速上升，使细胞发生铁死亡现象。目前，Yang 等[14]从口腔癌组织免疫组化的结果中发现核心生物钟基因(PER1)与GPX4和SLC7A11 的表达水平呈显著负相关(P<0.01)。从组织培养的角度发现当PER1 过表达时，肿瘤体积缩小了4 倍，重量则减轻了1 倍。随后的细胞实验则发现PER1 过表达可以使缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达水平下降9 倍，同时转铁蛋白受体(TFRC)表达升高了1 倍，SLC7A11 和GPX4 的表达则降低了接近30%。然而该过表达体系使用HIF-1α 激活剂处理后，GPX4 和SLC7A11 蛋白水平分别升高了50%和150%，而TFRC 的蛋白水平和细胞活性氧含量则下降了接近40%。上述的结果充分说明了PER1 与HIF-1α 形成的负反馈环对口腔癌细胞的铁死亡起到了重要的调节作用[16]。Li 等[17]和Hou 等[18]通过筛选和分析189 个铁死亡相关基因在口腔癌细胞和邻近正常组织之间的表达差异，发现其中14 个基因与口腔癌患者的预后存在极高的关联。值得注意的是，在上述14 个强关联的铁死亡基因中，ATG5、MAP1LC3A 和MAP3K5 等3 个基因同时对细胞自噬起到关键作用；细胞自噬也会激活铁蛋白FTH1 的降解，引发细胞铁死亡(表1)。该现象表明口腔癌细胞的自噬和铁死亡之间可能存在关键的相互作用。这些结果都可能为优化癌症联合治疗提供一个有前景的思路。

此外，也有诸多研究表明RNA参与了口腔癌细胞铁死亡机制的调控。Yang 等[31]发现当环状RNA FNDC3B(circFNDC3B)过表达时，口腔癌细胞增值速度提高了2.5 倍。然而当circFNDC3B 的表达受到miR-520d-5p 抑制时，细胞中SLC7A11 和GPX4 的表达出现显著降低(P<0.01)，铁离子和活性氧水平升高了近80%，证明了circFNDC3B 可以通过调节铁死亡保护相关蛋白从而抑制口腔癌细胞的铁死亡。除此之外，近年来也有数篇报道通过基因比对发现非编码RNA(ncRNA)也在口腔癌的发生发展中发挥着重要作用，并且能够利用ncRNA构建较为准确的口腔癌预后模型，但是其具体的作用机制仍待进一步的探索[1，32-33]。

2 口腔癌细胞焦亡

与常见的细胞凋亡不同，细胞焦亡是一种由Caspase-1介导的程序性细胞死亡形式。在识别外源性或内源性信号后，细胞会经历炎性体组装、孔蛋白家族Gasdermin(GSDM)蛋白裂解、促炎细胞因子和其他细胞内容物释放等过程并最终导致炎性细胞死亡。根据GSDM 被激活的焦亡途径，细胞焦亡可以被分为炎症小体依赖性焦亡或非炎症小体依赖性焦亡。炎症小体依赖性焦亡的特点在于需要炎性小体受病毒或细菌刺激后激活Caspase-1/4/5/11 蛋白介导GSDMD的切割。将GSDMD 切割成N 端和C 端片段后，其中N-末端与膜上的磷脂酰肌醇结合并继续构建弧形、狭缝和环形寡聚体。这些寡聚体在细胞膜表面成孔以诱导裂解并开始细胞焦亡的过程[34-35]。Jiang等[36]通过敲低长链非编码RNA LINC00958 发现口腔癌细胞HSC4 中caspase-1 的表达水平下降了60%，IL-1β和IL-18 的表达水平也分别下降了近30%和50%，这表明LINC00958 抑制了炎症小体的活化并降低了细胞焦亡水平。非炎症小体依赖性焦亡则只需要各自蛋白酶的作用，而无需炎性小体复合物的激活。例如Caspase-3在被激活后直接切割GSDME生成GSDME的N端片段。该片段结构域与GSDMD的N端结构域相似，都会导致细胞膜孔形成和细胞焦亡[37-38]。近年来，诸多研究认为GSDME与肿瘤免疫的关系密切，当Caspase-3 介导的细胞焦亡机制被细胞毒性化合物或放射线激活时，GSDME 可以发挥抗肿瘤作用[39-40]。Wang等[41]利用siRNA 抑制GSDME表达后，发现顺铂诱导的焦亡细胞率相较于未敲除细胞下降了20%，同时细胞免疫因子IL-1b、IL-6 和CCL-2 的转录水平也下降了近50%。当低表达GSDME 的SCC7 细胞接种到小鼠中则可见顺铂用药15 d 后肿瘤大小与同条件的shRNA 阴性对照组的小鼠相比增大了近6 倍。可见GSDME的减少不仅可以避免化疗药物激活口腔癌细胞的焦亡机制，同时抑制了免疫原性物质的释放，从而对顺铂产生耐药性。此外部分基因也可能通过其他途径影响口腔癌的焦亡。Zeng等[42]利用Lasso cox回归模型筛选并分析了细胞焦亡相关的调节基因与口腔癌患者预后的相关性。其中7 个基因(FAM72D、COL27A1、HIST1H3F、MAML3、LOC283314、FST 和MCEE)与口腔癌患者的预后呈现较强的关联性。但是上述基因在口腔癌细胞焦亡的过程中所发挥的具体作用仍待进一步探明。总体而言通过上调炎症小体和Caspase家族蛋白的表达促进细胞焦亡可能是开发耐药性口腔癌治疗方法的新思路。

3 细胞焦亡与铁死亡在口腔癌治疗中的研究

3.1 基于纳米材料的口腔癌靶向治疗工具 纳米材料作为可定制的靶向药物递送工具，能够在保留健康细胞的前提下将化疗药物或治疗基因运送到癌细胞中[43]。近年来，纳米材料诱导癌细胞的铁死亡成为耐药性癌症治疗的潜在思路。Huang等[44]发现零价铁纳米粒子可以诱导芬顿反应引发细胞内活性氧物质激增，进而激活耐药型口腔癌细胞的铁死亡现象。邢如霄[45]则将维甲酸和二茂铁两种功能基团组装成纳米粒子，当该纳米粒子与谷胱甘肽相遇后立即发生解离。解离后的两部分则可以在抑制SLC7A11 表达的同时大幅度地消耗口腔肿瘤细胞内谷胱甘肽，使细胞内活性氧水平大幅上升。同时由于正常细胞内GSH含量较低，因此该纳米粒子基本不会在正常组织细胞内解离，对正常组织细胞无毒副作用。光动力疗法(PDT)是近年来兴起的肿瘤治疗方式，该疗法将光敏剂输送到肿瘤部位，随后用某些波长的光照射使光敏剂产生细胞毒性和活性氧[34]。然而细胞内的过氧化氢浓度有限，无法分解出能够破坏细胞所需的活性氧浓度，使光动力疗法无法达到预期的效果；因此Zhu等[47]尝试联合细胞铁死亡机制与光动力疗法，利用芬顿反应提高活性氧含量，从而破解光动力疗法的瓶颈。从实验结果可见，当光敏剂二氢卟酚e6(Ce6)与铁死亡诱导剂Erastin 通过超分子相互作用组装成纳米颗粒组成纳米药物后，凋亡细胞率相较于Ce6 单体提高了63.1%。蛋白质印迹显示，Ce6-erastin 纳米颗粒与游离的Ce6/erastin 混合物组相比显著下调了GPX4的表达。小鼠实验则发现注射Ce6-erastin 纳米颗粒后肿瘤体积增长明显放缓，肿瘤抑制率高达70.6%，相较于游离的Ce6/erastin 混合物组提高了17.8%，而单Ce6的抑制率仅有46.1%。上述结果充分表明纳米材料与细胞铁死亡的交叉研究可以为口腔癌治疗提供新的思路和理论基础。

3.2 基于小分子RNA的口腔癌细胞代谢调节 由19~25个核苷酸组成的小分子RNA(miRNA)在细胞分化、细胞周期调节和细胞凋亡等过程中发挥着重要作用。在癌症治疗中，miRNA 可以在干扰恶性肿瘤的特殊代谢通路的同时减少对周围正常组织的影响。Zhou 等[48]将缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的小分子干扰RNA(siRNA)与二氧化钛-钌基光敏材料(TiO2@Ru)组合成纳米颗粒TiO2@Ru@siRNA。通过细胞实验可见经激光处理后含TiO2@Ru@siRNA的细胞不仅从表观层面出现了焦亡引起的细胞肿胀、膜破裂和大量表面绒毛减少等现象，同时从蛋白层面可见Gasdermin D(GSDMD) 蛋白和Caspase-1 显著上调。小鼠实验则可见对照组病灶伴有糜烂、溃疡和边界不清的内源性生长，而TiO2@Ru@siRNA 介导组病灶显著中断了恶性转化过程。TiO2@Ru@siRNA 介导组的组织苏木精和伊红染色(H&E)评分则为对照组的一半(P<0.05)。在其他种类的癌细胞研究中，细胞铁死亡被证实与P53 通路相关，其中非编码RNA miR-34c-3p对该通路起到了关键的调节作用[49-50]。Sun 等[51]则发现miR-34c-3p 在口腔癌细胞的铁死亡过程中同样具有重要作用。在miR-34c-3p 过表达的前提下，SLC7A11 蛋白表达水平下降了近3 倍，同时CCK8 结果也表明miR-34c-3p 的过表达可以显著降低口腔癌细胞的增殖和细胞活力。而SLC7A11 的过表达则可以扭转由miR-34c-3p 模拟物引起的增殖抑制，使细胞数量提升20%以上。这些现象也充分说明了miR-34c-3p 在口腔癌细胞的铁死亡调节中具有重要的作用。随着基因疗法与核酸药物的研究不断深入，针对Caspase蛋白家族和SLC7A11蛋白研发相关核酸抑制剂有望使口腔癌的临床治疗进入新的阶段。

3.3 化学药物的创新应用 随着研究者对癌细胞耐药机制和潜在治疗靶点的不断探索，部分用于治疗其他疾病的药物也被证实可以用于口腔癌的治疗。Yue 等[52]在细胞实验中发现常用于预防心血管疾病和糖尿病的花青素参与了口腔癌细胞的焦亡过程。经过花青素处理后，Caspase-1的炎症小体NLRP3的表达水平提高了6 倍，Caspase-1 的表达水平则提高了1 倍。当口腔癌细胞被Caspase-1 抑制剂AC-YVAD-CMK处理后，细胞活性则不再受花青素的影响；同时基因NLRP3的表达水平相较于单青花素处理组下降了3倍，Caspase-1 的表达水平也下降了60%以上。与花青素不同的是，毛兰素通过诱导GSDME表达促进口腔癌细胞焦亡。Luo等[53]在口腔癌细胞实验中给药后12 h可见GSDME-N片段的表达水平相较于给药前提升了约5 倍，给药后24 h 的表达水平则相较于给药前提升了约12 倍。除了调节焦亡相关基因的表达可以减少口腔癌细胞对顺铂产生耐药性以外，通过促进细胞铁死亡也可以提高耐顺铂癌细胞的杀伤效果。Lu 等[54]发现鼠尾草酸可以在不伤害正常口腔组织的前提下促进耐顺铂口腔癌细胞死亡。经鼠尾草酸处理后的耐顺铂口腔癌细胞内谷胱甘肽减少了近50%，同时细胞内活性氧含量提高了1倍以上。通过进一步研究还发现耐顺铂口腔癌细胞经处理后与化学耐药相关的Nrf2-HO1-xCT 信号蛋白含量下降了近1 倍，若利用rNrf2 质粒增强Nrf2 信号蛋白的表达则可以有效逆转耐药癌细胞的铁死亡，从而恢复癌细胞的耐药水平。除了增强口腔癌疗效，细胞焦亡的深入探究也可以用于减轻放化疗引起的副作用。口腔黏膜和胃肠道不适是口腔癌化疗过程中最常见的副作用。Huang等[55]在口腔癌细胞和周围组织的免疫染色结果中发现，正常组织细胞的GSDME表达水平相较于口腔癌细胞上调了27.5%。而使用维生素D 抑制Caspase 相关炎症信号后，免疫印迹结果显示GSDME 和Caspase-3 的表达显著减少，同时细胞死亡率下降了近30%。表明顺铂引起的化疗副作用与正常组织细胞中GSDME的裂解存在较强关联，且高浓度维生素D可促进正常组织保护并减少化疗副作用。因此针对口腔癌细胞的铁死亡和焦亡机制展开深入研究可以有助于研究者开发新药以应对传统化疗带来的耐药性和副作用，提高患者治疗的依从性。

3.4 细胞焦亡与铁死亡双诱导联合抗癌治疗 如前言所述，细胞焦亡和铁死亡机制具有高度的关联性。两者除了可以被同时激活以外，Zhou等[56]在黑色素瘤细胞中证明了Tom20-Bax-caspase-GSDME 信号通路通过激活ROS 信号传导参与了细胞焦亡。Xu等[57]也在转铁蛋白纳米药物的研究中发现细胞铁死亡过程中IL-1β、LDH和GSDMD 的表达水平均出现了不同程度的上调，表明铁离子和ROS水平的上升也可以激活细胞焦亡。虽然上述报道尚未在口腔癌细胞中得到进一步确认，但是深入研究口腔癌细胞焦亡和铁死亡之间的关联与串扰将有助于为两者的联合疗法提供新的思路。

4 结语

近年来由于大多数肿瘤对细胞凋亡具有先天抗性，新兴的生物学发现和技术创新与传统疗法的结合已成为高效治疗癌症的趋势。但是以细胞焦亡和铁死亡机制为中心的口腔癌治疗研究仍处在初级阶段。随着免疫学、分子生物学、生物信息学以及纳米技术的发展，未来需要更多的细胞与临床试验来研究以细胞焦亡和铁死亡为中心的口腔癌治疗和新药研发策略。