NK2同源框蛋白-1在胚胎反复种植失败中的研究进展

匡云琪，蔡金凤，姚颖杰，寸金涛，肖彭莹 综述 张若鹏，，3 审校

1.大理大学临床医学院，云南 大理 671000；2.昆明市妇幼保健院生殖医学中心，云南 昆明 650118；3.大理大学昆明市妇幼保健院研究生培养基地，云南 昆明 650118

近年来，体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)技术的发展速度突飞猛进，成功率在临床实践中也是逐步攀升，但是由于患者个体差异等诸多因素的影响，仍有少部分人在多次植入胚胎后存在失败的现象，称为反复种植失败(RIF)，其在辅助生殖受孕中发生率约为10%[1]。RIF不仅是导致非自然受孕女性低妊娠率的主要原因，也是辅助生殖领域存在的难题和研究热点。有关RIF目前相对统一的定义是Coughlan 等[2]2014 年提出的：年龄在40 岁以下的妇女，经历至少3 次体外受精周期，移植至少4 枚优质胚胎(新鲜或冷冻胚胎)后仍未实现临床妊娠。妊娠成功是多因素协调作用的结果，其不仅取决于优秀的胚胎质量，也依赖于顺利的胚胎着床过程以及良好的子宫内膜容受性。内膜容受性是指在月经周期的第20~24 天这一窗口期，子宫内膜在雌孕激素作用下拥有允许胚胎黏附、侵入并诱导内膜间质发生一系列变化，从而使胚胎得以顺利着床的能力[3]。因此，任何导致胚胎质量异常、着床过程受阻、子宫内膜容受性降低以及胚胎与子宫内膜发育不同步的因素都会促使RIF 的发生。近年来，随着对转录因子NKX2-1 的深入了解，发现它在涉及胚胎成功着床的各个方面都发挥了调控作用，其在生殖过程中的重要性日益凸显。本文就NKX2-1在胚胎种植过程中的相关作用机制予以综述。

1 NKX2-1简介

1.1 NKX2-1 的基因结构 NKX2-1 是NKX2转录基因家族成员之一，由NKX2.1基因所编码，位于人类染色体14q13上，是一种同源结构域蛋白。1990年，Guazzi等[4]从小牛的甲状腺组织中提取并克隆出该基因的cDNA，发现其能够与人类甲状腺过氧化物酶基因中的增强子结合，也称为甲状腺转录因子-1 (thyroid transcription factor-1，TTF-1)或甲状腺特异性增强结合蛋白(thyroid specific enhancer-binding protein，T-EBP)。NKX2-1 蛋白是一种相对分子量为38 kb 的序列高度保守的核蛋白，由371个氨基酸编码组成，编码区包括三个外显子和两个内含子，其转录产物长度约为2.3 kb[5-6]。NKX2-1的三级结构包括1个DNA结合域和2 个转录活性域。DNA 结合域是由60 个氨基酸残基组成的螺旋结构，可识别并结合活化T细胞核因子(NFAT)、视黄酸受体(RAR)、锌指GATA转录因子6(GATA6)等转录因子中的5'-CAAG-3'核心序列。两个活性域分别为位于N 端第51~123 个氨基酸残基之间具有亲水性的酸性激活结构域以及位于C 端第295~372 个氨基酸残基之间起抑制作用的反式激活结构域，可转录激活环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CBP)、类固醇受体共激活因子-1(SRC-1)、核因子-κB(NF-κB)、STAT3、SMAD3 等[7-9]。此外，NKX2-1 启动子的活性是由FOXA、Sp1、Sp3、GATA26及HOXB3转录因子共同调节完成的。最近有研究发现，诸如LMO3、E2F3、cyclinB1、cyclinB2、MUC5A、FGFR1 和MET 等许多潜在靶点也对NKX2-1 的转录活性起抑制或诱导作用[10]，进一步提示NKX2-1 调控网络的复杂性。

1.2 NKX2-1在不同组织中的表达 NKX2-1在胚胎发育和分化过程中特异性表达于甲状腺、肺和大脑的部分区域，对这些组织的早期发育十分关键，其表达受到严格的调控。出生后NKX2-1表达于下丘脑神经元的部分亚群，包括促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)神经元和下丘脑腹外侧核的前脑啡肽能神经元，参与对性成熟和生殖内分泌的调控[11]。青春期开始前下丘脑中NKX2-1 mRNA表达水平会短暂升高，在性成熟开始时达到高峰，之后表达降低，提示青春期的启动机制可能与NKX2-1 的调控网络有关。后有研究证实，亲吻素(Kiss1)基因可能是NKX2-1 的潜在靶点，NKX2-1 通过直接调节Kiss1 的表达来促进下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus-pituitary-gonadal，HPG)轴中GnRH的释放[12-13]，从而促进青春期的启动。研究也发现，NKX2-1表达缺失的小鼠会表现出青春期发育延迟及生殖能力下降，也与上述理论相符。研究还指出，NKX2-1还可表达于成熟的甲状腺组织和肺终末呼吸单位中，在参与其组织分化、功能维持及编码组织蛋白表达等方面发挥了至关重要的作用。文献报道称，NKX2-1在女性生殖系统及其病变中也有不同程度的表达。张越等[14]发现NKX2-1在正常子宫内膜中的表达显著高于子宫内膜病变者，提示其表达可能与内膜组织的功能维持及病变过程有关。Fujiwara 等[15]发现NKX2-1 在卵巢癌早期和晚期的表达率不同，其在卵巢癌中的表达是一个独立的良好预后因素。此外，NKX2-1的表达也受到磷酸化、糖基化、乙酰化等多种共价修饰调节及氧化-还原调控等。

2 NKX2-1与生殖调控因子

成功妊娠需要子宫内膜转变为接受态并拥有允许囊胚定位、黏附和侵入的能力，这一过程的改变涉及到多种细胞因子和黏附分子的调控，而NKX2-1 可通过作用于这些生殖调控因子从而影响胚胎着床过程。现就NKX2-1与一些生殖调控因子之间的关系展开综述，探究其对胚胎植入过程的双重影响。

2.1 NKX2-1 与上皮型钙黏附蛋白 上皮型钙黏附蛋白(E-Cadherin，E-cad)是一种分子量为120~130 kDa的Ca2+依赖的同亲型结合单链跨膜糖蛋白，主要在上皮组织中表达，介导上皮组织形态、功能的维持以及同种细胞之间的黏附，是钙黏附蛋白家族中研究最为透彻的成员之一。众所周知，胚胎在着床过程会涉及到子宫上皮细胞外基质的广泛降解、重塑以及滋养层细胞和上皮细胞表型的改变。研究发现，E-cad可以通过降低基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、MMP-9 的表达和活性，进而影响着床过程中细胞外基质的重塑，以发挥对胚胎着床的调控作用[16]，同时E-cad在诱导胚胎的侵袭性和上皮表型的建立中也扮演了非常重要的角色。此外，E-cad在月经周期的不同时段表达水平不同。研究显示，胚胎植入前期也就是分泌中期E-cad高表达于滋养细胞和子宫上皮细胞表面，有利于胚泡的黏附和植入，而在植入后期滋养外胚层表面E-cad 表达降低，导致细胞迁移和浸润能力增强，有利于绒毛外滋养细胞对子宫肌层的适度浸润侵袭。Nelson 等[17]的研究发现，E-cad 还可通过调节β-catenin 的活性间接影响wnt 信号通路，参与着床过程中的胚胎黏附。子宫内膜异位症患者上皮细胞中E-cad 的表达无显著的周期性变化，可能也是导致不孕的原因之一[18]。研究发现，NKX2-1作为E-cad的上游调控因子，其可以通过促进E-Cad的表达来介导胚胎着床过程。

2.2 NKX2-1 与降钙素 降钙素(calcitonin，CT)是一种由甲状腺滤泡旁细胞合成和分泌的多肽类激素,主要生理功能是抑制骨盐吸收及促进肾脏对Ca2+的排泄，调节体内血Ca2+水平。研究发现，降钙素在子宫内膜上皮细胞中也有微量表达，是胚胎着床过程中重要的调节因子之一。着床前孕激素会诱导降钙素的表达，在着床窗口期降钙素的表达特异性增强，其表达时间与子宫接受窗口重合，提示降钙素可能是子宫接受胚胎着床的标志。据报道降钙素还可以促进滋养层细胞的生长，在着床前阶段抑制降钙素mRNA会使胚胎数量大大减少。众所周知，肝素结合表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)和白细胞抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)的表达对于囊胚附着和侵袭过程来说是必不可少的。最新发现称心脏和神经嵴衍生物蛋白2(HAND2)对子宫的接受性、蜕膜化改变以及胚胎植入也有积极促进作用。降钙素不仅通过刺激包括腺苷酸环化酶和磷脂酶C (AC/PLC)在内的多条Ca2+信号转导通路促进囊胚的植入和上调HB-EGF 的表达[19]，还可以通过ERK1/2-mTOR 信号通路过表达HAND2和LIF，下调miR-223-3p 水平，从而增强子宫内膜的容受性[20]。研究发现，降钙素还可以促进子宫上皮细胞外Ca2+内流，通过升高细胞内Ca2+浓度以促进内膜蜕膜化改变和胚泡的生长发育，同时降低宫腔内Ca2+水平，使子宫内膜维持静息状态，有利于胚胎的成功着床。此外，降钙素的上调也会导致E-cad mRNA 水平降低，使子宫上皮细胞重塑,更易于滋养层细胞的侵入与穿透。王伟等[21]还发现降钙素基因相关肽(calcitonin gene-relatedpeptide，CGRP)在蜕膜细胞中表达，通过活化有丝分裂原活化蛋白激酶P38 (P38 mitogen-activatedprotein kinase，P38MAPK) 促进囊胚形成和诱导滋养层细胞分化。这些研究结果都表明CT及CGRP 在胚胎着床过程发挥了至关重要的作用。Suzuki 等[22]研究发现，NKX2-1 可以与甲状腺滤泡旁细胞中钙敏感受体(Ca2+-sensing receptor，CaSR)、钙调素和降钙素基因的5'侧区域特定结构结合，调控CaSR基因、CT 基因以及CT/CGRP 基因的表达。据此推测，NKX2-1 也可通过作用于子宫细胞中表达的CT 及CGRP，进而发挥在生殖活动中的有利调控作用。

2.3 NKX2-1 与胞间紧密连接蛋白 子宫内膜上皮细胞达到容受状态需要经历特殊的结构与功能改变，这一过程涉及到紧密连接蛋白的变化。紧密连接(tight junction，TJ)是位于子宫内膜上皮细胞最顶端的连接复合体，具有屏障和栅栏特性，不仅负责调控细胞旁物质的跨膜运输及维持细胞极性状态，还与妊娠期内膜容受性的形成有关。Occludin、Claudin-1 都属于紧密连接蛋白成员。Occludin的表达水平下调使子宫上皮细胞极性下降，细胞黏附分子在膜上的分布被改变，减少胚泡着床的机械屏障，促进胚泡的黏附与子宫内膜容受性的建立[23]。植入过程中，Occludin、Claudin-1 等紧密连接蛋白还与上皮型钙黏附蛋白等一起构成复杂的纤维网络复合体，介导胚胎定位黏附以及滋养层细胞对子宫的侵入。研究发现，NKX2-1通过直接作用于Occludin 和Claudin-1 的启动子并对其进行转录激活，进而间接调控胚胎种植过程[24-25]。

2.4 NKX2-1 与叉头框蛋白O1 叉头框蛋白O1(forkhead box-O1，FOXO1)是FOXO转录家族中的一员，其可作为阻遏剂或激活剂在细胞增殖、分化和凋亡等多种细胞过程发挥重要作用。Vasquez 等[26]实验发现在Cre 小鼠模型中子宫内膜Foxo1 的消融，会导致参与细胞侵袭、凋亡、分子转运和β-连环蛋白信号通路激活的子宫转录本基因表达发生改变，促使子宫上皮细胞极性改变和凋亡，不利于胚胎穿透管腔上皮，进而导致不孕。由此证明Foxo1 可能是体内调节子宫内膜容受性的关键因子。Zhong 等[27]研究发现Foxo1通过直接结合NKX2-1基因，在介导肺泡上皮细胞分化及维持细胞稳态中发挥了核心作用。故此可以推测，NKX2-1也能通过作用于靶点Foxo1来影响子宫上皮细胞的极性，使子宫转变为适合胚胎植入的可接受状态，但具体作用机制还需有待进一步探究。

2.5 NKX2-1 与瘦素 瘦素是由脂肪组织分泌的一种分子量为16 kDa的多肽类激素，主要通过与靶细胞膜上的瘦素受体结合发挥生物学效应。研究发现，子宫内膜上也存在瘦素及其受体的表达，并且通过多种途径对生殖功能发挥着调控作用。最近一些研究显示，瘦素可以上调LIF、整合素αvβ3 以及白介素-1(interleukin-1，IL-1)等细胞因子的表达水平，在子宫内膜容受性的建立中发挥有利作用。更有研究表明，瘦素通过激活MAPK 和PI3K 信号级联来诱导滋养细胞人白细胞抗原-G (human leucocyte antigen-G，HLA-G)的表达，参与滋养层细胞对母体的先天性和适应性免疫。Ding 等[28]实验证明瘦素siRNA 可通过抑制JAK2/STAT3 的激活及上调神经肽Y2 受体的表达促进卵巢颗粒细胞凋亡并影响雌、孕激素合成，而雌、孕激素水平会直接影响子宫内膜的形态和胞饮突的表达水平。Santos等[29]在研究中指出不明原因的RIF患者子宫内膜中的瘦素表达明显低于对照组(正常生育组)，相反其受体表达高于对照组。研究结果显示，瘦素不但可以上调其受体的表达，而且瘦素及其受体表达谱的变化也参与了子宫容受性的发展，未来可能成为预测着床失败的新标志物。除了影响子宫内膜容受性以外，瘦素也会影响胚胎植入。研究表明，瘦素可以通过激活JAK2/STAT3信号通路，使子宫内膜表面γ型上皮组织钠通道(γ-epithelial Na+channel，γ-ENaC)表达下降，影响子宫液的吸收以及子宫的“闭合”，从而损害胚泡着床[30]。子宫内膜中NKX2-1 与瘦素的相互作用目前尚无明确报道。但Chen 等[31]的研究发现，在Ⅱ型肺泡上皮细胞中，瘦素不仅通过NKX2-1依赖机制提高胎儿肺成熟度并上调肺表面活性蛋白A(SP-A)的表达，同时也参与了对NKX2-1 表达的调控以及转录活性的调节，提示瘦素与NKX2-1 之间关系密切，其可能是NKX2-1 转录调节的潜在靶点。NKX2-1也可能通过瘦素途径来发挥对子宫内膜容受性的调控作用。

2.6 NKX2-1 与环氧合酶-2 环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2，COX-2)是前列腺素生物合成的限速酶。据报道女性生殖系统中也存在COX-2的表达，主要参与调节女性排卵、胚胎着床和子宫蜕膜化等生殖过程。研究发现，在促性腺激素诱导的排卵峰作用下，卵巢颗粒细胞上会出现COX-2 的特异性表达，提示其表达水平与排卵过程密切相关。COX-2 合成的前列腺素(PGs)也与排卵过程中卵丘形成有关。张慧雅等[32]实验证明卵巢颗粒细胞中COX-2 的表达与卵细胞受精率、优质胚胎率和妊娠率相关。研究显示，COX-2可以通过促进前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的合成来上调整合素αvβ3 及血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)的表达，参与着床部位子宫内膜血管网的建立和子宫内膜蜕膜化的发生，提高胚胎的种植率。Achache 等[33]发现在IVF-ET辅助受孕患者中，反复胚胎植入失败者的磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)和COX-2 表达水平很低，提示前列腺素合成过程受阻会降低子宫内膜容受性，进而使胚胎的种植率下降。Chang等[34]研究发现，在大鼠下丘脑非神经元细胞中，NKX2-1 可与COX-2启动子中的特定区域结合并抑制COX-2 的转录。由此推测在子宫内膜细胞中，NKX2-1 也可能通过下调COX-2 mRNA 的表达水平，降低内膜容受性，导致胚胎植入失败的发生。

3 NKX2-1与母胎免疫

良好的妊娠结局依赖于母体免疫系统的稳定，而NKX2-1 异常表达会影响甲状腺的功能进而引起机体免疫紊乱。在甲状腺组织中，促甲状腺激素(TSH)、促甲状腺素受体(TSHR)、甲状腺球蛋白(TG)及主要组织相容性复合物1 (MHC-1)等多种分子的表达都受到NKX2-1 的调节。研究表明，TTF-1 可直接或通过TG、TSH/TSHR-cAMP信号途径方式间接上调MHC-1 及TSHR 的表达，过度呈递自身抗原，导致甲状腺自身免疫功能紊乱。而甲状腺免疫功能紊乱会激活T淋巴细胞，导致外周血中CD4+T 细胞之间的平衡被打破，进一步导致子宫内膜界面的免疫状态受损，影响胚胎植入[35]。Safarian 等[36]的研究指出甲状腺抗体的产生也对胚胎有毒性作用，主要表现为限制滋养层细胞的侵袭和阻碍胎儿的正常发育，进而导致不良妊娠结局的发生。

4 展望

虽然已有研究表明，转录因子NKX2-1 可以通过调控子宫内膜表面与胚胎黏附、侵入及着床相关的多种细胞因子和黏附分子的表达，以及通过影响自身免疫的平衡，在妊娠过程中发挥双重作用。但是由于NKX2-1 转录调控机制的复杂性，它是否还通过其他多种信号通路作用于生殖过程从而导致反复种植失败的发生，这一过程仍未完全探究清楚。未来需要对NKX2-1的下游进行更加深入的研究，明确NKX2-1复杂的调控网络及其在胚胎植入失败中的具体作用机制，以期能够提高辅助生殖受孕患者的临床妊娠率。