基于网络药理学探讨桂枝生姜枳实汤治疗冠心病不稳定型心绞痛的作用机制

姜家铮 姚昆鹏 龙 云

1.湖南中医药大学，湖南长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007

冠心病不稳定型心绞痛（unstable angina，UA）是我国常见心血管疾病，截至2020 年，我国累计冠心病患者1139 万[1]，城乡居民冠心病病死率分别为120.18/10 万和128.24/10 万[2]。UA 为冠状动脉硬化、脂质沉积长期发展的结果[3-4]，常具有不可逆性，西药治疗予以调脂稳斑、抗血小板聚集、改善心肌血供、减轻心肌氧耗等[5]。然而，患者依从性差、经济负担重等因素，在一定程度上限制了UA 的西医治疗。中医药治疗UA 效优价廉，无论依从性及经济角度，都具有较大优势。

桂枝生姜枳实汤系东汉张仲景于《金匮要略》中所载，“心中痞，诸逆，心悬痛，桂枝生姜枳实汤主之[6]”。此方温阳化饮，下气降逆，临床多用于痰饮所致心胃阳气不足之冠心病、心绞痛等[7]，然作用机制尚待进一步研究。

网络药理学方法将现有生物信息学数据库与计算机技术结合，获取实用的医学信息[8-9]。通过明确上下游靶点来阐释生物学过程，对于探索中医遣方用药规律具有重大作用，尤其适合中药复方的研究[10-11]。2021 年世界中医药学会联合会发布的《网络药理学评价方法指南》[12]起到进一步的指导作用[13]。本研究拟使用网络药理学的方法，探讨桂枝生姜枳实汤治疗UA 的作用机制，以期为今后的体内、外实验及相关药效学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 有效成分的筛选和作用靶点的预测

通过TCMSP 数据库检索桂枝生姜枳实汤的药物成分及作用靶点，条件设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，设置类药性（drug likeness，DL）≥0.18，所得靶点通过UniProt 数据库规范为标准化基因名。

1.2 获取疾病相关靶点

以关键词“unstable angina”在GeneCards、PharmGkb、DrugBank 数据库中检索UA 的疾病靶点。再设置筛选条件“Relevance Score ≥1”，将获取的疾病靶点作进一步筛滤。

1.3 筛选药物-疾病核心作用基因

通过Perl 软件来比对以上药物作用靶点与疾病靶点，获得药物-疾病核心作用基因。进而使用Cytoscape 3.8.0 软件建立中药成分-靶点的网络图谱。

1.4 构建蛋白质相互作用（PPI）网络及拓扑分析

利用STRING 平台建立交集靶点PPI 网络，获得桂枝生姜枳实汤治疗UA 的关键基因。再通过Cytoscape 3.8.0 软件进行拓扑分析。

1.5 基因功能富集与通路富集分析

利用R 语言软件对药物-UA 疾病交集靶基因进行基因本体论（gene ontology，GO）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomics，KEGG）富集分析，涵盖其生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF），找到差异最显著的生物学通路，并将结果进行可视化。

2 结果

2.1 有效成分筛选以及作用靶标预测

桂枝生姜枳实汤的药物成分共检索到34 种，其中桂枝7 种，生姜5 种，枳实22 种。经靶标预测确定靶点139 个。

2.2 获取UA的疾病靶点

检索上述疾病数据库并筛选去重后可得UA 疾病靶共899 个。将药物靶点与疾病靶点比对，获得77 个交集靶点。见图1。

图1 疾病靶点与药物靶点交集Venn 图

2.3 筛选药物-疾病核心作用基因

基于Cytoscape 3.8.0 软件平台，将交集靶点进行整合，绘制“药物-成分-靶点”图，见图2。共有相关靶点104 个，相互关系231 种。枳实中有效成分对应靶点最多，其中木犀草素（luteolin）、柚皮素（naringenin）、川陈皮素（nobiletin）分别与35、23、23 个靶点相关。有效成分中对应靶点数最多的是PTSG2 基因（24 个），其次PTGS1 基因（17 个）和HSP90AA1 基因（17 个）。

图2 桂枝生姜枳实汤干预UA 的药物-成分-靶点图

2.4 构建PPI网络与拓扑分析

将交集靶点导入STRING 平台及Cytoscape 3.8.0软件，构建PPI 网络并可视化，见图3，共计靶点63 个，相互关系185 种。利用CytoNCA 插件拓扑分析，共获得核心基因6 个，按DC 排序为TP53、MAPK3、MAPK1、AKT1、ESR1、JUN，见图4。

图3 桂枝生姜枳实汤治疗UA 主要靶点的PPI 网络图

图4 交集基因拓扑分析

2.5 GO/KEGG分析

将交集基因富集分析，得到GO 条目2085 个，其中BP 1917 个，CC 67 个，MF 101 个，选前10 建立柱状图（图5A）；得到KEGG 通路152 条，选前30 建立气泡图（图5B）。在GO 富集中发现活性氧代谢过程、氧化应激反应、膜筏+膜微结构域、泛素样蛋白连接酶结合、转录因子活性等生物过程在桂枝生姜枳实汤治疗UA 过程中起到关键作用。在KEGG 富集分析中发现，与UA 相关的通路主要有PI3K-Akt、IL-17、HIF-1、p53 信号通路等。见图5B。

图5 桂枝生姜枳实汤潜在靶点的富集分析

3 讨论

冠心病不稳定型心绞痛为西医病名，系冠状动脉粥样硬化致血管腔狭窄/痉挛，心脏供血供氧不足，进而心肌缺血的一类疾病。传统中医无此病名，根据其发病症状多归为“胸痹心痛”。阳虚寒凝、血瘀痰浊被认为是UA 的主要证型[14]。张仲景在《金匮要略》有云：“夫脉当取太过不及，阳微阴弦，即胸痹而痛，所以然者，责其极虚也。”点明胸痹心痛病机为阳微阴弦，宜从温阳立法。桂枝生姜枳实汤为温阳法的代表，桂枝温通心阳，生姜发越水气，枳实除痞下气，共奏通阳化饮，降逆理气之功。

本研究发现，枳实中有效成分对应靶点最多，其中木犀草素、柚皮素、川陈皮素可能是桂枝生姜枳实汤治疗UA 的核心成分。木犀草素可抑制炎症、抗氧化应激，对冠心病、高血压等多种心血管疾病具有防治作用，其机制与激活PI3K/Akt、TLR-4/NF-κB 信号通路，调节p53 等下游靶蛋白的表达密切相关[15]。此外，木犀草素可活化PI3K/Akt/mTOR 信号通路，改善心功能，抑制心室重构[16]。线粒体功能障碍是心肌缺血再灌注（MI/R）诱导心肌细胞凋亡中的关键一环，改善线粒体损伤对治疗UA 意义重大。柚皮素可直接抑制线粒体氧化应激损伤并保持线粒体功能，从而减轻MI/R 损伤，AMPK-SIRT3 信号在此过程中发挥关键作用[17]。川陈皮素具有抗血栓、抗血凝、抗炎、抗胆碱酯酶等作用[18]，可通过激活PI3K/Akt 信号通路，发挥抗心肌细胞损伤的作用，减少大鼠心肌细胞凋亡，在心血管领域有较好的应用前景[19]。

目前对UA 的研究集中在降低血脂水平，改善缺氧所致的氧化应激、血管内皮损伤等。本研究GO 富集结果显示，桂枝生姜枳实汤干预UA 主要通过两方面，一为调节氧代谢，改善氧化应激；二为调节细胞膜的通透性，促进转录因子的结合。这与目前已知的UA 发病机制相对应。KEGG 富集分析提示参与桂枝生姜枳实汤干预UA 的通路主要有PI3K-Akt、IL-17、HIF-1、p53 等，均为经典的炎症/氧化应激/细胞凋亡相关通路，表明桂枝生姜枳实汤可能由此发挥抗心绞痛作用。

目前尚无关于桂枝生姜知枳实汤的有效成分、靶点和机制的报道。本研究通过网络药理学分析，桂枝生姜枳实汤可能通过激活PI3K-Akt、IL-17、HIF-1、p53 等信号通路，调节TP53、MAPK3、MAPK1、AKT1、ESR1、JUN 等下游靶基因，改善缺氧所致心肌损伤，达到治疗UA 的作用。然而本研究尚有一定的局限性，如数据库收录的数据有限，中药成分研究尚不完整，以及缺乏相关体外细胞实验支持等，因此需要进一步的实验验证。