宏基因组二代测序技术对疑似中枢神经系统感染性疾病的病原诊断价值

林 霞 颉满珍 王根绪 张庆华 赵傲楠

1.甘肃省天水市第一人民医院神经内一科，甘肃天水 741000；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院神经内科，上海 200025

中枢神经系统感染性疾病是病原微生物侵犯中枢神经系统的脑实质、被膜及血管等引起的急性或慢性炎性疾病，因高发病率和病死率已成为神经内科的重点关注疾病。传统的脑脊液培养可以识别30%～40%的中枢神经系统感染（包括脑膜炎和脑炎）的病原体[1]，不能满足临床需要，患者无法得到早期诊断及精准用药。2017 年，宏基因二代测序被法国“成人感染性脑炎管理指南”推荐为1 级证据，以协助中枢神经系统感染的临床决策[2]。文献[3]报道显示宏基因二代测序可提高中枢神经系统感染病原体的诊断率，但其阳性率仅22%。本研究旨在探究宏基因二代测序在疑似中枢神经系统感染性疾病中的病原诊断价值，阐明其在中枢神经系统感染性疾病中的临床优化。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性收集2020 年7 月至2021 年12 月就诊于天水市第一人民医院神经内一科40 例疑似中枢神经系统感染患者，其中，男23 例，女17 例，年龄15 ～74 岁，平均（50.33±16.28）岁。患者及家属均知情并且同意配合本研究进行的随访调研工作。本研究通过天水市第一人民医院医学伦理委员会批准。

纳入标准[4-6]：①急性、亚急性或慢性起病；②有上呼吸道感染的前驱症状或腹泻等感染症状；③神经功能缺损症状，脑膜刺激征、精神行为异常、认知功能下降、癫痫、意识障碍、言语障碍、肢体瘫痪等；④神经影像学提示脑炎、脑膜炎；⑤入院前未接受治疗。排除标准：其他系统感染性疾病。

1.2 方法

全部入组患者行血常规、病毒五项、呼吸道病原体联检。脑脊液常规与生化、脑脊液抗酸染色与墨汁染色、脑脊液结核DNA 与单纯疱疹病毒DNA检测、头颅MRI 检查。无菌采集脑脊液样本5 ml于无菌管内，全程干冰运输，-20℃保存，外送至予果生物科技有限公司（西咸新区予果微码生物科技有限公司）进行宏基因二代测序。运用PACEseq病原微生物高通量基因检测，是基于IIUmina 平台的宏基因组测序技术，检测样本中的全部核酸序列，并与微生物基因组数据库进行比对和分析。

1.3 观察指标及评价标准

血常规：白细胞4 ～10×109/L、中性粒细胞百分比40%～70%、淋巴细胞百分比20%～40%，病毒五项阴性，呼吸道病原体联检阴性，颅内压80 ～180 mmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa），脑脊液细胞数0 ～5×106/L，蛋白质0.15 ～0.45 g/L，葡萄糖2.5 ～4.5 mmol/L，氯化物120 ～132 mmol/L，脑脊液抗酸染色阴性，墨汁染色阴性，脑脊液结核DNA 阴性，单纯疱疹病毒DNA 阴性。头颅MRI 检查结果、宏基因组二代测序结果。

1.4 主要仪器及设备

采用德国罗氏cobas c701、cobas e601 全自动生化分析仪、CT 机为64 排螺旋CT（飞利浦公司），3.0T 核磁共振（荷兰飞利浦Ingenia）或1.5T 核磁共振（德国西门子公司）。宏基因二代测序是予果生物科技有限公司（西咸新区予果微码生物科技有限公司）运用PACEseq 病原微生物高通量基因检测，基于IIUmina 平台的测序技术。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计学软件进行数据统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，计数资料以[n（%）]表示。

2 结果

2.1 一般资料

40 例患者，病程3 h 至6 个月，急性起病29 例，亚急性起病5 例，慢性起病6 例。40 例患者临床表现多样，其中，头痛29 例（72.50%）；发热22 例（55.00%），体温波动在38 ～41℃；精神异常8 例（20.00%）；恶心、呕吐6 例（15.00%）；咳嗽、言语异常、肢体抽搐各3 例（7.50%）；意识障碍、颈部疼痛、腹胀、头晕、咽痛、肢体无力各2 例（5.00%）；腹痛、腹泻、吞咽困难各1 例（2.50%）。

2.2 血常规、病毒五项、呼吸道病原体联检、脑脊液检测、头颅影像学检查结果

40 例患者，血细胞分析正常26 例（65.00%），异常14 例（35.00%）。中性粒细胞百分比正常10 例（25.00%），增高30 例（75.00%）。淋巴细胞百分比正常8 例（20.00%），增高3 例（7.50%），降低29 例（72.50%）。病毒五项阴性40 例（100.00%）。呼吸道病原体联检阳性1 例（2.50%），流感病毒抗体阳性1 例（2.50%）。脑脊液检查，颅内压正常27 例（67.50%），增高13 例（32.50%）。细胞数正常14 例（35.00%），增高26 例（65.00%），波动区间（8 ～9889）×106/L。其中，淋巴细胞占优势17 例（65.38%），多核细胞占优势9 例（34.62%）。蛋白质正常11 例（27.50%），增高29 例（72.50%）。葡萄糖正常25 例（62.50%），增高6 例（15.00%），降低9 例（22.50%）。氯化物正常16 例（40.00%），降低24 例（60.00%）。脑脊液抗酸染色、墨汁染色、结核DNA、单纯疱疹病毒DNA均阴性。头颅MRI 检查，16 例（40.00%）头颅MRI 未见明显异常。14 例（35.00%）颅内散在脱髓鞘；5 例（12.50%）颅内多发缺血灶、腔隙灶；2 例（5.00%）颞叶、丘脑病灶、幕上脑室扩大。1 例（2.50%）双侧海马、岛叶、胼胝体、枕叶、尾状核头病灶。

2.3 宏基因二代测序结果

本研究脑脊液宏基因二代测序40 例，RNA 检测14 例，阴性14 例（100.00%）。DNA 检测40 例，阴性4 例（10.00%），阳性36 例（90.00%）。检出病毒17 例（42.50%）（表1）。化脓性细菌5 例（12.50%），结核分枝杆菌复合群2 例（5.00%），真菌2 例（5.00%），罕见病原体10 例（25.00%）。经综合判定，宏基因二代测序假阴性4 例（10.00%），假阳性13 例（32.50%）。

表1 DNA病毒宏基因二代测序结果

2.4 宏基因二代测序和最终诊断之间的一致性分析

本研究临床诊断的判定为综合患者病史、发病季节、症状体征、临床特征、各项检查化验、宏基因二代测序结果、对治疗的反应和转归等，分别由2 名主治医师和2 名副高及以上医师根据中枢神经系统感染性疾病的指南的诊断标准各自进行独立诊断，最终诊断与宏基因二代测序相应病原体对比分析，对意见不统一的病例进行讨论后确定。将临床诊断的可靠性划分为4 个等级，确定的、很可能的、可能的、无法判断的。可能的和无法判断的患者将被排除。本研究40 例临床疑似中枢神经系统感染患者，最终全部确诊中枢神经系统感染，诊断病毒性脑炎23 例，化脓性脑膜炎5 例，流行性乙型脑炎、李斯特脑炎、结核性脑膜炎各3 例，真菌脑炎、布氏杆菌脑炎、伤寒脑炎各1 例。宏基因二代测序结果与最终临床诊断结果对比分析，宏基因二代测序敏感性为85.19%，假阳性13 例，假阳性率为32.50%，假阴性4 例，假阴性率为10.00%。宏基因二代测序与最终诊断的符合率（表2）。

表2 宏基因二代测序诊断符合率

3 讨论

中枢神经系统感染性疾病是神经内科常见疾病，其病原学的诊断主要需要使用脑脊液涂片、病原体培养、抗原抗体检测、PCR 等相结合的方法，广泛且通常为阴性的系列检测，导致诊断延迟或漏诊，早期及时确诊病原体，识别和排除传染性病因，尽量满足临床需求是诊治中枢神经系统感染性疾病过程中遇到的困境。

脑脊液与中枢神经系统直接接触，被认为是识别各种神经系统疾病的重要来源，尤其在中枢神经系统感染性疾病的病原菌诊断中具有重要价值[7]。常规脑脊液检查，包括细胞数的增多程度、分类、蛋白质、葡萄糖、氯化物的变化在粗略区分细菌性脑膜炎、病毒性脑膜炎方面具有一定的鉴别价值，但同时也存在局限性，部分疾病在脑脊液细胞学的表现重叠，影响了诊断的特异性。对罕见菌感染，亦不能早期发现，容易延误治疗。

与传统的方法比较，宏基因组二代测序在检测细菌、病毒、寄生虫和真菌感染方面表现出更高的灵敏度，可以最大限度地提高整体诊断性能[8]。研究表明[9]宏基因二代测序虽具有能够识别范围广泛的潜在病原体的优势，但其在病毒性脑炎诊断中的敏感性仍然不如标准的基于扩增的检测。本研究显示宏基因二代测序对DNA 病毒的诊断符合率为39.13%，但结合患者综合信息、宏基因二代测序的病原体特异序列数和置信度分析，我们发现病原体特异序列数与诊断符合率呈正相关，当其小于10，或存在多种病原体共存时，其诊断符合率低，而当特异性序列大于10，其对DNA 病毒病原体的诊断符合率为100.00%，提示根据特异性病原体序列数可辅助判定宏基因二代测序的准确性。另外本研究显示病毒性脑炎最常见病原体是水痘带状疱疹病毒（VZV）、单纯疱疹病毒1 型（HSV-1）、EB 病毒（EBV）。与相关研究一致[10]。

研究报道[11]宏基因二代测序技术诊断1 例流行性乙型脑炎患者，因高热、头痛、意识不清入院，临床疑诊病毒性脑膜脑炎或自身免疫性脑炎，脑脊液表现不典型，根据典型的头颅影像学特点怀疑黄病毒感染，行宏基因二代测序最终确诊流行性乙型脑炎。本研究宏基因二代测序脑脊液RNA 检测14 例，全部阴性，其中，3 例流行性乙型脑炎患者，宏基因二代测序均为阴性，诊断符合率为0。结合患者病史、症状体征、发病季节及头颅影像学检查，高度怀疑流行性乙型脑炎，经血清学、脑脊液检验流行性乙型脑炎抗体阳性，最终确诊。显示宏基因二代测序技术对RNA 病毒的敏感性低，可能与RNA 病毒的提取方法、病毒繁殖周期特点及脑脊液采样时间等有关。因样本量少，需后续追踪观察。

研究报道[12]宏基因二代测序对结核性脑膜炎诊断的敏感性中等，而特异性高，诊断效果好，可作为结核性脑膜炎的早期诊断方法。本研究显示宏基因二代测序对结核分枝杆菌诊断符合率为66.67%，与上述研究结果一致。另有文献报道[13]宏基因二代测序诊断具有挑战性的罕见病原体感染的亚急性或慢性脑膜炎病例，包括蛛网膜下腔神经囊虫病、米曲霉菌引起的中枢神经系统血管炎、都柏林梭菌脑膜炎等。本研究真菌、罕见病原体诊断符合率均达100.00%，其诊断敏感性高，值得临床推广应用。提示宏基因二代测序技术在诊断中枢神经系统结核分枝杆菌、真菌及罕见病原体确定方面具有重要价值。

本研究亦存在一些局限性，本研究临床诊断的确诊是结合患者的病史、发病季节、症状体征、临床特征、辅助检查、宏基因二代测序结果、对治疗的反应和转归等进行判定，未对宏基因二代测序的结果进行进一步PCR、病原体培养或一代测序验证。理论上，宏基因二代测序可用于检测临床样本中的所有病原体，但需排除标本污染、背景菌干扰等情况，存在假阳性、假阴性，需综合分析判断。因此，需注意取标本时间，是否处于病毒高峰期，标本的规范化留取、储存、转运，同时需改进 DNA/RNA 共提取方法，对DNA 和RNA 进行测序，提取效率、定植与感染的区分以及方法标准化[14-15]，以提高检测率。

总之，宏基因二代测序技术对确定DNA 病毒、细菌、结核分枝杆菌、真菌、罕见病原体感染敏感性高，但其对RNA 病毒流行性乙型脑炎病毒的敏感性低。临床怀疑流行性乙型脑炎时，需谨慎分析宏基因二代测序的结果，与常规检验方法结合，综合判定，以早期诊断，精准治疗，改善患者预后。