长链非编码RNA CDKN2BAS在子宫内膜癌组织表达及其生物学功能研究

彭 浩，张印星，谢 环（.黄石市中心医院/湖北理工学院附属医院妇产科，湖北黄石 435000；.宜昌市第二人民医院/三峡大学第二人民医院妇产科，湖北宜昌 443000）

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）作为绝经后女性高发生殖道恶性肿瘤，发病率和死亡率不断升高[1]，对女性健康危害严重。随着现有诊疗水平不断进步，患者总体预后得到了很大改善[2]，但鉴于EC 机制尚未明确，晚期患者治疗效果有限[3]，加之治疗后易出现复发及多药耐药[4]，对患者生存率的提高带来巨大挑战。长链非编码RNAs（long non-coding RNAs，LncRNAs）是一种含有超200nt核苷酸但不具备蛋白编码能力的RNA，可通过调控转录、转录后、表观遗传等而实现生物学作用[5]，以被发现与恶性肿瘤进程密切相关，参与了肿瘤细胞恶性增殖及侵袭[6]。LncRNA CDKN2BAS 作为一种反义编码的LncRNA，参与调控多项生理病理过程，与结直肠癌[7]、骨肉瘤[8]和非小细胞肺癌[9]等密切相关。本研究分析了EC 组织中LncRNA CDKN2BAS 表达，并观察该基因对人EC 细胞HEC-1B 生物学功能的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2018年3月～2021年3月在黄石市中心医院接受手术治疗的EC 患者107 例患者作为研究对象，纳入标准：①初治，术前未接受任何治疗；②术后病理学检查确证；③临床资料完整。排除标准：①重要脏器严重功能不全；②并发有急慢性感染、其他妇科疾病、免疫系统疾患或其他系统恶性肿瘤者。平均年龄52.67±11.57 岁，根据国际妇产科联盟（FIGO）分期标准：Ⅰ～Ⅱ期71 例，Ⅲ～Ⅳ期36 例；组织学分级：G1 级37 例，G2 级36 例，G3 级34 例；伴有淋巴结转移33 例。将术中切除的EC 组织及离EC 边缘＞3cm 癌旁组织用生理盐水冲洗后，快速置于液氮中，-80℃保管。本研究由医院伦理委员会审核通过，患者均签署知情同意书。HEC-1B 细胞株购自上海通派生物公司，置于保种管内，于液氮罐中-80℃保存。

1.2 仪器与试剂 酶标仪（美国Thermo 公司）；实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；总RNA提取液（北京索莱宝公司）；逆转录及qPCR 试剂盒（美国Sigma 公司）；LncRNA CDKN2BAS 和内参引物（上海生工生物公司）；RPMI-1640 培养液、胎牛血清及胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；Lipofectamine 2000 试剂（美国Invitrogen 公司）；LncRNA CDKN2BAS 抑制序列及对照序列（上海美轩生物公司）；MTT 液（武汉益普生物公司）；Transwell 小室（美国Corning 公司）；基质胶（上海研卉生物公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR方法检测组织中LncRNA CDKN2BAS表达：取冻存组织，按Trizol 法提取总RNA，经检测浓度及纯度合格后，取总RNA 按逆转录试剂盒操作获得cDNA，按qPCR 试剂盒操作步骤以cDNA 为模板扩增引物，序列：LncRNA CDKN2BAS：上游：5’-TGCCGGAGCTGTCGACCC-3’，下游：5’-TTTGA TCTCTGCTGTTGAATCAGAATG-3’；GAPDH 上游：5’-CTCCTGCATGCCACGGA-3’，下游：5’-AGAC CCTTACAGTTAGTCGT-3’。反应条件：94℃ 3min；94℃ 30s，58℃ 30s，76℃ 30s，循环38 次，用2-△△Ct法分析LncRNA CDKN2BAS 表达量。

1.3.2 细胞培养及处理：在含5%（v/v）CO2，37℃培养箱中用RPMI-1640 培养液（含10g/dl 胎牛血清）对HEC-1B 细胞培养。将对数期细胞接种在6 孔板，待细胞生长至90%以上融合度时，用Lipofectamine 2000 试剂开展转染：①siRNA 组：转染LncRNA CDKN2BAS 抑制序列：5’-GGUCAUCUCAU UGCUCUAU-3’；②si-NC 组：转染对照序列：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’；③C 组：不作任何处理。处理后各组培养48h。

1.3.3 qRT-PCR 方法检测细胞中LncRNA CDKN2BAS表达：取处理后培养48h 细胞，加入裂解液，其余操作同1.3.1。

1.3.4 MTT 实验：取方法1.3.2 中处理后培养的各组细胞，制备单细胞悬液，密度2.5×104/ml，按100μl/孔接种在96 孔板，继续培养。分别在12，24，48，72 和96h 时，各孔加入MTT 液20μl，培养4h，去除上清，加入二甲基亚砜150μl，振荡使结晶溶解，使用酶标仪检测各孔吸光度A值。重复实验3 次。

1.3.5 Transwell 实验：①迁移能力：收集方法1.3.2中处理后培养的各组细胞，离心取细胞沉淀，用无血清培养液制备密度2.5×105/ml 的悬液，并取200μl 加入小室上室内，取600μl 含10g/dl 胎牛血清的培养液加入下室，培养24h，将小室取出，将未穿膜细胞用棉签擦去，固定，0.1%结晶紫染色，镜下计数穿膜细胞数。重复实验3 次。③侵袭能力：用预冷培养液对基质胶稀释后均匀铺在小室上室，干燥备用，其余操作步骤同迁移能力检测。

1.4 统计学分析 应用SPSS 21.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以均值±标准差（±s）表示，两组数据资料比较采用独立样本t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA CDKN2BAS 在EC 癌组织和癌旁组织中表达量比较 EC 癌组织中LncRNA CDKN2BAS表达量为2.73±0.25，高于癌旁组织中的1.00±0.13，差异具有统计学意义（t=63.903，P＜0.001）。

2.2 EC 癌组织中LncRNA CDKN2BAS 表达量与临床指标相关性 见表1。EC 癌组织中LncRNA CDKN2 BAS 表达量与年龄、浸润深度无关（均P＞0.05），LncRNA CDKN2BAS在FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级G3 级和出现淋巴结转移的EC 癌组织中的表达量较Ⅰ～Ⅱ期，G1-G2 级和未出现淋巴结转移的EC 组织明显升高，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 不同临床指标的EC 组织中LncRNA CDKN2BAS表达量比较（n=107,±s）

表1 不同临床指标的EC 组织中LncRNA CDKN2BAS表达量比较（n=107,±s）

类 别n LncRNA CDKN2BAS表达量tP年龄（岁）＜53452.69±0.221.289 0.200≥53622.75±0.26浸润深度 ≤1/2432.68±0.211.633 0.106＞1/2642.76±0.26 FIGO 分期 Ⅰ～Ⅱ期712.67±0.233.246 0.002Ⅲ～Ⅳ期362.83±0.25组织学分级 G1～G2 级732.67±0.223.894＜0.001 G3 级342.85±0.24淋巴结转移 是332.84±0.263.270 0.001否742.68±0.22

2.3 三组细胞中LncRNA CDKN2BAS 表达量比较 siRNA 组、si-NC 组和C 组细胞中LncRNA CDKN2BAS 表达量分别为0.30±0.12，1.02±0.10和1.01±0.12，与si-NC 组和C 组比较，siRNA 组细胞中LncRNA CDKN2BAS 表达量明显降低，差异有统计学意义（F=77.210，P＜0.001）。

2.4 三组细胞增殖活性比较 见表2。siRNA 组细胞24，48，72 和96h 时A值低于si-NC 组和C 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组细胞增殖活性比较（A 值，±s）

表2 各组细胞增殖活性比较（A 值，±s）

注：与C 组比较，*t=-2.868,-2.942,-2.638,-2.594,均P＜0.05；与si-NC 组比较，#t=-2.938,-5.083,-3.049,-2.740,均P＜0.05。

时间（h） siRNA 组si-NC 组C 组FP 120.22±0.10 0.23±0.11 0.21±0.06 0.0590.943 240.32±0.11*# 0.51±0.12 0.53±0.15 5.3390.018 480.47±0.05*# 0.65±0.07 0.61±0.11 8.4950.003 720.56±0.13*# 0.78±0.11 0.73±0.07 6.4690.009 960.73±0.10*# 0.86±0.07 0.87±0.09 5.0030.022

2.5 三组细胞迁移和侵袭力比较 见表3。siRNA组迁移细胞数和侵袭细胞数低于si-NC 组（t=-5.468,-5.928）和C 组（t=-5.887,-5.741），差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 不同组细胞迁移和侵袭力比较（±s 个）

表3 不同组细胞迁移和侵袭力比较（±s 个）

类别siRNA 组si-NC 组C 组FP迁移细胞 104.83±8.38 130.50±6.50 132.50±9.29 21.956＜0.001侵袭细胞 86.33±10.01 121.17±10.96 119.33±9.40 22.407＜0.001

3 讨论

随着肿瘤治疗手段的不断进步，多数EC 患者早期接受规范诊疗五年生存率较高，但仍有约1/3的患者发现时已至进展期，治疗效果不佳，病死率高[10]。目前，EC 病因不明，发病过程涉及众多基因和信号通路，因此，深入研究EC 发病机制，寻找与病程进展相关基因，对指导患者诊疗意义重大。

LncRNAs 作为一种广泛存在于机体且功能复杂的非编码RNA，可发挥致癌或抑癌功能参与肿瘤病程进展[11]，有研究指出[12]，EC 和正常内膜组织中LncRNAs 表达出现显著差异。亦有研究指出[13]，LncRNAs 有望成为EC 治疗的潜在性靶标。LncRNA CDKN2BAS 也被称作ANRIL（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子4b(inhibitors of cyclin-dependent kinase 4b,INK4b）位点的反义非编码RNA（antisense noncodina RNA in the INK4 locus），主要定位于细胞核内的LncRNA，与多种疾病病程关系密切，YU 等[14]研究发现，LncRNA CDKN2BAS与颅内动脉瘤之间存在显著关系。有研究指出[15]，LncRNA CDKN2BAS基因多态性与南印度人群牙周炎和冠状动脉疾病相关。可能是动脉粥样硬化的遗传标志物[16]。随着研究深入，LncRNA CDKN2BAS在肿瘤发病中的作用越来越受到重视，研究发现[17]，LncRNA CDKN2BAS 通过靶向miR-181a，激活HMGB1 诱导细胞自噬是致癌的关键。WANG 等[18]指出，LncRNA CDKN2BAS 可加剧卵巢癌进展。研究发现[19]，LncRNA CDKN2BAS 在膀胱尿路上皮癌组织中高表达，且与吉西他滨敏感度有关。本研究中，EC 组织中LncRNA CDKN2BAS 表达量高于癌旁组织，说明LncRNA CDKN2BAS 在EC 癌组织中表达升高，可能作为致癌基因参与了EC 发生。同时，本研究结果显示，LncRNA CDKN2BAS与代表EC 恶性进展的指标密切相关，如FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级G3 级和出现淋巴结转移的EC 组织中表达量显著升高，提示其可能参与了EC 进展。

HUANG 等[20]研究指出，LncRNA CDKN2BAS通过靶向miR-99a 抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖。亦有研究发现[21]，敲除LncRNA CDKN2BAS 可通过抑制NF-κB 信号传导增加细胞凋亡，抑制胃癌生长，抑制癌细胞迁移。本研究利用转染小分子干扰物的方式沉默人EC 细胞HEC-1B 中LncRNA CDKN2BAS 表达，结果显示，siRNA 组细胞中LncRNA CDKN2BAS 表达量低于si-NC 组和C 组，说明HEC-1B 细胞中LncRNA CDKN2BAS 表达被干扰。本研究结果显示，siRNA 组细胞24，48，72和96h 时A值低于si-NC 组和C 组，说明LncRNA CDKN2BAS 表达与HEC-1B 细胞增殖活性相关，沉默细胞中LncRNA CDKN2BAS 表达可显著抑制细胞增殖能力。本研究结果显示，siRNA 组迁移细胞数和侵袭细胞数低于si-NC 组和C 组，说明LncRNA CDKN2BAS 基因与HEC-1B 细胞迁移和侵袭有关，沉默LncRNA CDKN2BAS 表达可明显减少迁移和侵袭数量。

综上所述，EC 组织中LncRNA CDKN2BAS表达量升高，沉默人EC 细胞HEC-1B 中LncRNA CDKN2BAS 表达可抑制细胞增殖活性，减少细胞迁移和侵袭数量，有望为EC 机制研究及临床诊疗提供新的靶位，但其具体作用通路有待开展进一步的研究予以证实。