糖尿病肾病患者血清miR-495-3p和LncRNA NEAT1表达水平及其与患者预后的相关性研究

刘 慧，钟娇影，刘 杰，陈秀娟（河北以岭医院肾病科，石家庄 050000）

糖尿病肾病（diabetes nephropathy，DN）是2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）常见并发症，具有高发病率和死亡率[1-2]。尿蛋白是肾功能生物标志物之一，可反映肾小球损伤及其对大分子的通透性增加，但其变异性大、敏感度低[3]。因此临床急需有效的辅助检测指标，以提高预后不良DN 高危患者的检出率。LI 等[4]研究通过数据库预测和文献筛选，确定长链非编码RNA 核富集转录体1（long noncoding RNA nuclear-enriched abundant transcript 1，LncRNA NEAT1）参与的LncRNA-miRNA-mRNA网络与早期DN疾病进展有关。微小RNA（microRNA，miR）-495-3p 靶向调控核孔蛋白160 可参与DN 的足细胞损伤[5]。miR-495-3p 与LncRNA NEAT1 间存在靶向关系，但二者在DN 预后中的作用仍不明确。因此，本研究旨在探讨血清miR-495-3p 和LncRNA NEAT1 水平在DN 患者预后预测中的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 纳入河北以岭医院2019年1月～2021年1月收治的116 例DN 患者作为DN组（均为T2DM 患者），其中男性60 例，女性56例；平均年龄59.84±11.35 岁；＜60 岁67 例，≥60 岁49 例。另收集同期单纯T2DM 患者102 例作为T2DM 组，男性54 例，女性48 例，平均年龄59.76±11.15 岁。纳入标准：①DN 诊断符合《糖尿病肾病诊治专家共识》[6]，T2DM 诊断符合《糖尿病分型诊断中国专家共识》[7]；②临床资料完整且能配合随访；③年龄＞18 周岁，本人自愿参与研究。排除标准：①并发尿路感染、急慢性肾小球肾炎或其他肾病者；②并发甲状腺疾病、酮症酸中毒或其他代谢疾病者；③既往有肾毒性药物及免疫抑制剂服用史者；④孕妇、哺乳期妇女或有精神障碍性疾病者。同期健康体检者100 例作为对照组，男性58 例，女性42 例，平均年龄59.94±10.27 岁。对照组、T2DM 组和DN 组性别、年龄比较，差异无统计学意义（F/χ2=0.007，0.931，P=0.993，0.628）。研究获取医院伦理委员会批准，研究对象均提供知情同意书。

1.2 仪器与试剂 RNA 提取试剂盒（上海瓦兰生物科技有限公司，货号：K1101）；第一链反转录试剂盒（上海经科化学科技有限公司，货号：ZR102）；SYBR Green Master Mix（美国ABI 公司，货号：4367659）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：采集研究对象清晨空腹静脉血样10 ml，室温静置1 h，4℃，3 000 r/min 离心15 min，取血清，置于-80℃备用。

1.3.2 采用实时荧光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）法检测血清miR-495-3p 和LncRNA NEAT1 相对表达水平：依照RNA 提取试剂盒说明书提取总RNA，采用Nanodrop 2000c 超微量紫外分光光度计检测RNA 浓度和纯度，A260nm/A280nm比值为1.8～2.1 则样本合格，第一链反转录试剂盒反转录合成cDNA，反应体系：上下游引物各0.8μl，cDNA 2μl，SYBR Green Master Mix 10μl，ddH2O 补足至20 μl。反应参数：95℃ 5 min；95℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因miR-495-3p 和LncRNA NEAT1 相对表达量，引物由上海科敏生物科技有限公司合成，序列：miR-495-3p 上游5’- CGTCCTGACATGATGC ATGAC-3’，下游5’- TCAGGCTCGCACTAAGCGT CG -3’；U6 上游5’- GCGAGCCTCATGAGGAGCG C -3’，下游5’- CAGTAGACGTGAGCTGTCACAC-3’；LncRNA NEAT1 上游5’- CGATACAGCAATGAC ATCCGA-3’，下游5’- ATGCAGCATCGCCCACTG GAGA-3’；GAPDH上游5’- CTGTACAGCCGCTTAA GCACG -3’，下游5’- CGTGACGCCTACGTACCGT AC -3’。

1.3.3 分组及随访：根据肾脏病理损伤程度（肾小球分级）分为I 级组32 例，II 级组36 例，III 级组25 例，IV 级组23 例。采用电话随访及门诊复查治疗的随访方式，随访终点为2021年7月，记录其估算肾小球滤过率（estimate glomerular filtration rate，eGFR）（终末期肾病标准eGFR＜15 ml/min/1.73 m2），根据治疗后6 个月随访期间是否发展为终末期肾病分为预后良好组(n=76)和预后不良组(n=40)。

1.4 统计学分析 采用软件SPSS 25.0 进行所有数据的统计分析，采用均数±标准差（±s）表示计量资料，计量资料均服从正态分布，两组采用独立样本t检验，多组采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用SNK-q检验；采用受试者工作特征（receiver operator characteristic,ROC）曲线分析血清miR-495-3p 和LncRNA NEAT1 水平对DN 患者预后的预测价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平比较 对照组、T2DM 组和DN 组血清miR-495-3p水平（1.02±0.25，0.76±0.22，0.58±0.16）依次降低，而LncRNA NEAT1 水平（1.01±0.23，1.58±0.29，2.16±0.36）依次升高，差异有统计学意义（F=117.238，391.506，均P＜0.05）。T2DM组、DN 组与对照组比较（t=12.385,21.615,18.999,38.529,均P＜0.05）；DN组与T2DM组比较（t=8.889,20.042,均P＜0.05），差异均有统计学意义。

2.2 血清miR 495 3p，LncRNA NEAT1 水平与DN 患者临床病理参数的关系 见表1。T2DM 病程≥10年，eGFR ≥60 ml/min/1.73 m2，FBG ≥8mmol/L，24 h 尿蛋白≥3 g/24 h 的血清miR-495-3p 水平低于对应项，LncRNA NEAT1 水平高于对应项，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平与DN 患者临床病理参数的关系（±）

2.3 不同肾脏病理损伤程度DN 患者血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平比较 I 级组、II 级组、III级组和IV级组血清miR-495-3p水平（0.74±0.19，0.61±0.16，0.50±0.08，0.39±0.06）依次降低，LncRNA NEAT1水平（1.69±0.30，2.08±0.32，2.34±0.35，2.74±0.39）依次升高，差异有统计学意义（F=30.586,46.729,均P＜0.05）。II 级组、III 级组、IV 级组与I 级组比较（t=5.341,8.975,12.781,6.725,10.243,16.157,均P＜0.05）；III 级组，IV 级组与II 级组比较（t=4.218,8.227,4.201,10.400,均P＜0.05）；IV 级组与III 级组比较（t=3.801,5.823,均P＜0.05），差异均有统计学意义。

2.4 不同预后DN 患者血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平比较 预后不良组血清miR-495-3p 水平（0.45±0.10）低于预后良好组（0.65±0.17），LncRNA NEAT1 水平（2.53±0.47）高于预后良好组（1.97±0.36），差异有统计学意义（t=6.836,7.148，均P＜0.05）。

2.5 血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平对DN患者预后的预测价值 绘制ROC 曲线分析miR-495-3p 和LncRNA NEAT1 的预测价值，结果显示，血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平单独及联合预测DN 患者预后不良的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.784（95%CI: 0.702～0.867），0.753（95%CI: 0.658～0.848）和0.834（95%CI: 0.755～0.912），特异度分别为71.1%，86.8%和77.6%，敏感度分别为62.5%，57.5%和77.5%。miR-495-3p，LncRNA NEAT1 预测截断值分别为0.51，2.34。见图1。

图1 血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平预测DN患者预后的ROC 曲线

3 讨论

T2DM 是由于胰岛素作用缺陷、胰岛素分泌缺陷或两者兼而有之而导致高血糖[8]。T2DM 的微血管并发症会导致DN，其通常与血压升高相关，若不及时治疗会导致终末期肾病[9-10]。生物标记物的早期检测对DN 早期诊断、早期治疗有重要意义。

LncRNA NEAT1 可促进DN 疾病中上皮间质转化，且在DN 患者血清和尿液中过度表达[11]。本研究LncRNA NEAT1 表达趋势与上述研究一致。提示LncRNA NEAT1 表达升高可能参与DN 疾病进展。WU 等[12]研究指出LncRNA NEAT1 高表达与DN 小鼠肾小球系膜细胞SV40 MES13 的增殖、氧化应激、炎症和纤维化有关。据此推测LncRNA NEAT1可能通过调节肾小球细胞的增殖、氧化应激、炎症和纤维化等一系列生物进展，参与DN 的发生发展。miRNA 关系网络复杂，一个miRNA 可由多个LncRNA 调节，且一个miRNA 可调控多个靶基因和多个生物途径[13]。研究显示，miR-495-3p 可靶向调控CRBN 或TRAF6，参与脂多糖诱导的人肾皮质近曲小管上皮细胞损伤[14-15]。SHAN 等[16]研究表明，LncRNA MEG8 通过海绵miR-495-3p 促进相关基因表达，加重透明细胞肾细胞癌的致瘤性。本研究结果中DN 患者miR-495-3p 表达趋势与FAN 等[17]研究结果一致。基于既往研究推测miR-495-3p 低表达可能影响细胞活力、凋亡及炎症等过程，参与人肾皮质近曲小管上皮细胞损伤，进而推动DN 疾病进展。

既往研究显示，LncRNA 可通过调节mRNA合成、翻译以及干扰转录因子作用，在转录和转录后水平发挥基因表达调控作用[18]。GONG 等[19]研究表明，LncRNA NEAT1 下调可通过调节miR-330-5p/FOXO3 途径改善脂多糖诱导的肾细胞损伤。据此推测LncRNA NEAT1 可能在转录后水平调控miR-495-3p 表达，二者通过负调控作用共同影响DN 疾病进展。进一步分析认为病理作用下LncRNA NEAT1 表达升高，通过负调控降低miR-495-3p 表达，miR-495-3p 低表达后影响肾小球细胞活力及凋亡，推动DN 进展。血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 与DN 患者多个临床参数均有关。提示miR-495-3p，LncRNA NEAT1 可反映DN 疾病进展及严重程度，二者表达异常可能与肾小球受损有关。然而miR-495-3p，LncRNA NEAT1 参与DN疾病进展的具体作用机制仍待今后基础研究证实。

研究显示，肾脏损伤程度是DN 患者预后不良的重要因素，肾小球发生间质性损伤时可造成其滤过压加重，肾小球上皮进一步受损，最终导致疾病进展[20]。本研究结果中miR-495-3p 水平降低，LncRNA NEAT1 水平升高与肾脏病理损伤加重及预后不良有关。提示miR-495-3p，LncRNA NEAT1水平与DN 疾病进展及肾功能损伤程度有密切联系，可作为预测肾脏病理损伤程度的重要指标。此外miR-495-3p，LncRNA NEAT1 表达异常可能有一定肾脏毒性，加重肾小球损伤并参与终末期肾病发生。且ROC 曲线结果进一步表明二者联合检测水平更能为临床DN 预后提供可靠的信息，值得临床医师借鉴，当miR-495-3p 水平低于0.51，LncRNA NEAT1 水平高于2.34 时，发生不良结局的可能性更大。

综上，DN 患者血清miR-495-3p 低表达，LncRNA NEAT1高表达可能与DN的发生发展有关，二者有望成为DN 预后预测的生物指标。今后将进一步探索DN 发病机制，为治疗DN 提供新的靶基因。本研究的局限性在于：临床中DN 的影响因素众多，本研究未能纳入多个因素综合分析；miR-495-3p，LncRNA NEAT1 的预后评估效能仍需进一步优化。