健康献血者机采血小板储存中LncRNA LIPCAR的表达及初步研究

张文娟，郭 逸，段 勇，冯 娜，彭 鹏，景媛媛

（陕西省血液中心，西安 710061）

近年来，临床治疗开始大量选择成分输血，机采血小板因纯度高、临床疗效好、起效快等优点导致需求量越来越大，但其可用性和安全性受到血小板储存损伤（platelet sterage lesion,PSL）和细菌污染风险的限制[1]。PSL 是从采血到输血过程中发生在血小板中的生化和功能变化的总和[2-4]。对PSL深入的研究可以延长血小板的体外保存期，提高使用率和减少浪费。目前PSL 诊断主要依赖于对血小板形态、功能、代谢等方面的检测，寻找敏感度较高的生物学标志物来评价PSL 迫在眉睫。

长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是一种转录产物（＞200 个核苷酸长），尽管缺乏编码蛋白的功能，但LncRNA 通过多级调节途径调节基因表达，其可以在各种主要细胞功能（例如增殖、迁移和凋亡）中作为正相或者负相调节剂[5-8]。有研究表明，lncRNA 可以作为miRNA 海绵发挥作用进而调节疾病进程[9]。LncRNA 作为研究血小板的新兴关注点，与miRNA 相比，其在PSL 中的研究鲜有报道。

为了深入分析血小板储存过程中LncRNA 的表达与PSL 之间的关系，通过前期预实验，收集陕西省血液中心4 份正常机采血小板，利用Primerpremier 6.0 软件设计了多个LncRNAs（SENCR，SNHG9，LIPCAR，GAS5，H19，MIAT，LincRNA-p21，MEG3，UCA1 及MALAT1）引物，采用实时荧光定量RCR（real-time quantitative PCR,qRT-PCR）检测机采血小板中上述指标的表达水平，发现预测心脏重塑造的基因长链非编码RNA（long intergenic noncoding RNA predicting cardias remodeling,LIPCAR）的表达量变化对血小板储存时间延长比较敏感。本研究通过扩大样本量运用qRT-PCR 检测机采血小板在22±2℃恒温振荡保存箱内伴随储存时间延长，LIPCAR 的表达水平变化，分析LIPCAR对PSL 的影响和意义，为其将来在血小板领域的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集本站2021年11月～2022年7月健康献血者32 例，其中男性22 例，女性10 例，血型分别是11 例A Rh+，2 例B Rh+，2 例AB Rh+和17 例O Rh+，要求其在捐献机采血小板前7 天内不能服用抗生素或改变血小板功能的药物。所有样本经检验科乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病毒酶联免疫吸附试验及核酸检测结果均阴性，生化指标检测结果正常，符合临床病人输血相关检测要求。科研用成分血均通过西安市中心血站伦理委员会批准，献血者符合中华人民共和国卫生部规定的《献血者健康检查要求》（GB18467-2011）标准，采集后机采血小板样本pH 值检测结果（7.0±0.1），血小板计数、白细胞残余量计数、红细胞残留量计数合格，厌氧菌和需氧菌培养结果均为阴性，无细菌生长。质量检测结果均符合《全血及成分血质量要求》（GB18469-2012）的标准。

1.2 仪器与试剂 Trima accel 全自动血液成分分离机及配套管路（80300，泰尔茂比司特有限公司）；血小板恒温震荡保存箱（XHZ-IB DLP90，苏州医用仪器厂）；无菌接管机（TSCD-2，日本TERUMO 公司）；全自动血细胞计数仪（SYSMEXKX-21，日本希森美康公司）；残余白细胞计数仪（ADAM-rWBC，韩国纳诺恩泰）；血全自动细菌培养系统（BACTECFX 2000，美国BD 公司）；荧光定量PCR 仪（7500，美国ABI 公司）；超微量核酸检测仪（美国赛默飞公司）；逆转录试剂盒（货号AG11706，中国艾科瑞生物公司）；荧光定量PCR 试剂盒（货号AG11706，中国艾科瑞生物公司）；引物序列：β-actin 上游引物：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGC-3’；LIPCAR 上游引物：5’-TAAAGGATGCGTAGGGA TGG-3’，下游引物：5’-TTCATGATCACGCCCTCA TA-3’，PCR 引物合成（上海生工公司）。

1.3 方法

1.3.1 机采血小板的制备：应用Trima accel 血细胞分离机分离采集，全自动血细胞收集系统回路管组收集机采血小板，每单位血小板浓度标准为≥2.5×1011个，收集32 份健康机采血小板各100ml，置于20～24℃血小板恒温振荡保存箱内水平振荡保存。

1.3.2 机采血小板的分组：将收集的每人份机采血小板通过无菌接管机分成5 份，每份约20ml，保存于22±2℃恒温振荡保存箱内，于不同储存时间（1，3，5，7 和9 天）取出一份检测血小板质量指标，用qRT-PCR 对不同储存时间血小板中LIPCAR的表达水平进行检测。

1.3.3 LncRNA LIPCAR 表达水平检测：①血小板分离：将不同储存时间的血小板样本10 ml 倒入离心管，8000g 离心2 min，弃上清；向每5×106个细胞中加入1 ml 的RNAiso Plus，混匀，室温（15～30℃）静置5 min，分离RNA。②血小板RNA 提取：使用RNAiso Plus 提取血小板RNA，加入适量RNase-free 水溶解沉淀RNA。③使用反转录试剂盒进行操作，反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5s，4℃。④Real Time PCR：按两步法PCR扩增标准程序Stage 1：预变性，Reps：1，95℃ 30 s；Stage 2：PCR 反应，Reps：40，95℃ 5 s，60℃30～34 s。倍数变化被标准化为β-actin，并使用2-ΔΔCt方法计算表达量。

1.4 统计学分析 采用SPSS26.0 统计软件处理数据，不同储存时间LIPCAR 表达差异分析采用Kruskal Wallis 秩和检验，不同天数之间数据比较均采用两两多重比较的Bonferroni 矫正法计算矫正P值（Adj P），AdjP＜0.05 为差异具有统计学意义。针对LIPCAR 表达量与性别的关联性采用t检验，与血型关联性选用ANOVA 方差齐性分析，不同血型之间两两组间比较选用LSD 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR 检测LIPCAR 在正常机采血小板不同储存时间表达量 对同一捐献者机采血小板样本，于储存的第1，3，5，7，9 天进行qRT-PCR检测LIPCAR 表达量，发现伴随储存时间延长，LIPCAR 表达水平逐渐增高，数据总体差异存在统计意义（H=89.46，P＜0.001）。对不同储存天数之间LIPCAR 表达量进行两两多重比较，发现第1天与第3 天校正后的LIPCAR 表达量比较，差异无统计学意义（P=0.094）；第1 天和第5 天，第1天和第7 天，第1 天和第9 天校正后的LIPCAR 表达量比较，差异具有统计学意义（均P＜0.001）；第3 天和第7 天，第3 天和第9 天校正后的LIPCAR 表达量比较，差异具有统计学意义（均P＜0.001）；第5 天和第9 天校正后的LIPCAR 表达量比较，差异具有统计学意义（P=0.016），见图1。

图1 机采血小板样本不同储存时间（1，3，5，7，9d）LIPCAR 表达量qRT-PCR 检测结果（**P＜0.05）

2.2 机采血小板捐献者性别和血型差异与LIPCAR表达量关系 32 份机采血小板捐献者不同储存时间LIPCAR 表达量根据性别进行t检验分析，发现在第5 天和第1 天（t=2.189，P=0.038）、第7 天和第1 天（t=2.320，P=0.028）、第9 天和第1 天（t=2.264，P=0.032）男性表达量均高于女性，差异具有统计学意义，见图2A。根据血型不同进行ANOVA 方差齐性分析，总体存在同质性差异（F=3.160，P=0.043），差异具有统计学意义。进一步通过LSD 法进行两两组间比较，发现AB Rh+型与O Rh+型储存第7 天和第1 天LIPCAR 的表达水平差异有统计学意义（P=0.015），见图2B。

图2 机采血小板捐献者在不同储存时间LIPCAR 表达量与性别和血型的相关性分析

3 讨论

血液中，血小板是最小的无核细胞，其易变形、高度敏感，易进入小血管，可快速应激，在出血与止血、血栓形成、损伤反应和免疫调节等过程中发挥至关重要的作用[10]。血小板结构复杂，有细胞器、线粒体、致密小体、残核以及散在分布的颗粒成分。每个血小板均携带大量的核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）生物信息，通过快速、有效的应答来发挥作用。血小板中的线粒体与细胞核一样，具有DNA，双层细胞膜、细胞分裂周期等特点，在能量产生和代谢中发挥着重要作用。健康血小板通常包含5～8 个线粒体，其更新周期为9～24 天，而无核细胞血小板的平均存活时间为7～10 天，可能是由线粒体的更新周期决定的[11]。有研究证实B 淋巴细胞瘤-XL 可通过调节线粒体凋亡来决定血小板的存活时间[12]。LIPCAR 是线粒体长链非编码RNA，提示LIPCAR 是否可能参与调控血小板的线粒体通路。

LIPCAR 在心血管疾病发生发展、预后等方面的研究已比较深入。有研究证明LIPCAR 的过表达有可能是治疗动脉粥样硬化的潜在治疗靶标[13]。LIPCAR 可以预测心血管疾病患者的生存期，血浆中LIPCAR 的过表达可能是诊断ST 段抬高型心肌梗死的警告信号[14-15]。YAN 等[16]证明LIPCAR是急性心肌梗死后患者心力衰竭的潜在标志物。WANG 等[17]证实LIPCAR 通过调节TGF-β/Smad通路调节心房纤维化，为房颤的临床治疗提供了潜在的方法。在肿瘤研究领域，LIPCAR 在肝癌患者外周血和肝癌细胞株中均高表达，其可以促进肝细胞癌的增殖、迁移和转移，抑制肿瘤细胞凋亡[18]。

针对LncRNA 在血小板方面的研究报道，迄今仅局限于利用芯片进行表达谱分析。有学者通过对血小板浓缩液RNA 测序，共检测到2 923 个LncRNAs，其中1 413 个LncRNAs 的表达水平变化是明显的，42 种的水平上升，28 种的水平下降[19]。国内学者通过芯片研究发现有大量的LncRNAs 存在于血小板中，其表达量随着血小板储存时间的延长而呈现增高或降低不同的变化趋势，进一步分析表明部分变化的LncRNAs 与血小板聚集、激活、内吞等生理过程密切相关，并且在PSL 中发挥作用[20]。

本研究首次用大量健康献血者机采血小板样本依据储存时间不断延长，初步判定LIPCAR 表达水平不断增高。同时，发现不同性别、血型之间LIPCAR 表达量伴随储存时间延长具有显著性差异。通过分析推测由于机采血小板在体外时间延长，LIPCAR 表达反应性增多，并通过调控血小板的线粒体通路来调节蛋白质合成从而影响血小板的聚集和止血功能，不同人群性别和血型差异可能因为个体免疫系统对外界条件变化的敏感性不同而导致血小板功能差异，这与之前研究报道的血小板储存时间延长与免疫介导的输血反应风险增加结论相符。

总之，本实验使LIPCAR 在正常机采血小板方面的研究迈出第一步，为进一步探讨其在PSL 中的作用及分子机制提供了一定的实验依据。但同时，实验也有一定的局限性，具体LIPCAR 是如何参与调控PSL 的分子机制还需进行不断验证，后续会继续扩大样本量，细化指标分类，适当结合临床机采血小板患者输注后相关指标变化来研究其意义。