非肌层浸润性膀胱癌TURBT治疗患者血清UBC1和DJ-1表达水平及其对预后预测价值研究

邢俊杰，盛永亮，张浩然，刘春辉，李志军（河南科技大学第一附属医院泌尿外二科，河南洛阳 471000）

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，全球每年新发病例达57.3 万例，死亡病例达21.3 万例[1]。非肌层浸润膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)是最常见的膀胱癌类型，目前其治疗以经尿道膀胱肿瘤电切术(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)辅助术后灌注化疗为主，但仍有约50%～70%患者术后复发进展，危及生命[2]。尿路上皮癌相关基因1(upregulated in bladder cancer 1,UBC1)是一种长链非编码RNA，参与个体生长发育、细胞外基质重塑等病理生理过程[3]。近年来发现，UBC1 在胶质瘤、结直肠癌等[4-5]恶性肿瘤中表达升高，其通过促进肿瘤细胞的恶性增殖转移，导致患者不良生存预后。帕金森病相关蛋白-1（Parkinson’s disease associated protein-1，DJ-1）是肽酶C56 蛋白家族成员，参与细胞转化、细胞凋亡等多种生物学过程的调控[6]。HE 等[7]报道，前列腺癌中DJ-1 的表达升高通过诱导Kirsten 肉瘤病毒致癌基因的表达，促进肿瘤细胞的侵袭、迁移，是新的血清肿瘤标志物。目前NMIBC 患者血清中UBC1 和DJ-1 表达及两者的临床意义尚不清楚。本研究通过检测NMIBC 患者血清UBC1 和DJ-1 表达，探讨两者的临床预后预测价值，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2018年2月～2019年2月于河南科技大学第一附属医院接受TURBT 治疗的120 例NMIBC 患者为NMIBC 组。纳入标准：①经组织病理学检查明确诊断为NMIBC；②初次诊治，无放化疗治疗史；③临床病理及随访资料完整，患者及家属依从性好，对本研究知情同意并签字。排除标准：①并发其他恶性肿瘤；②并发急性膀胱炎、尿道狭窄及凝血功能异常等疾病；③并发严重肝肾功能障碍。NMIBC 组中，男性80 例，女性40例；年龄40～69（62.84±4.17）岁；有吸烟史72例；肿瘤直径≥3cm 者28 例，＜3cm 者92 例；肿瘤数目：单发77 例，多发43 例；肿瘤TNM 分期：Ta～Tis 期81 例，T1 期39 例；肿瘤分级：低级别75 例，高级别45 例。以同期健康体检的60例健康人群为对照组，其中男性50 例，女性30 例；年龄37～68（61.29±4.05）岁；有吸烟史35 例。两组在性别、年龄及吸烟史之间，差异无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经本院伦理委员会审核批准。

1.2 仪器与试剂 Varioskan LUX多功能酶标仪（美国赛默飞公司）。荧光定量PCR仪器（美国ABI公司，型号ABI7500）。UBC1 和GAPDH 引物由上海华大公司设计合成。人血清DJ-1 酶联免疫吸附试剂盒（上海梵态生物有限公司，货号PT4510）。逆转录试剂盒及2×SYBR Green Master Mix 试剂盒（北京索莱宝公司，货号T2240，SR1110）。

1.3 方法

1.3.1 血清UBC1，DJ-1 表达检测及分组：留取NMIBC 患者入院后次日清晨空腹静脉血，对照组健康体检时清晨空腹静脉血5ml，3 000 r/min 离心10min，分离上层血清。应用Trizol 法提取血清中总RNA，将总RNA 反转录为cDNA 后进行荧光定量PCR 反应。UBC1 上游引物：5’-CAAGAGGAGCCGGCTTAGCATCTA- 3’，下游引物：5’- ACGGTTCCAGTCCTCAGTCAG- 3’；GAPDH 上游引物：5’- CAAGAGGAGCCGGCTTAG CATCTA- 3’，下游引物：5’- ACGGTTCCAGTCCTC AGTCA- 3’。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40 个循环。总体系：SYBR Premix Master Mix 10μl，上下游引物各1μl，cDNA 2μl 和双蒸水 7ml。以GAPDH为内参，血清UBC1 的相对表达量采用2-△△Ct法表示。采用酶联免疫吸附测定法测定血清DJ-1 水平,实验操作严格遵照试剂盒说明书进行操作。分别根据血清UBC1，DJ-1 表达的平均值1.29，8.30 ng/ml 为界，分为UBC1 高表达组（n=59）和低表达组（n=61），DJ-1 高表达组（n=55）和低表达组（n=65）。

1.3.2 随访：所有NMIBC 患者TURBT 术后予以常规膀胱灌注化疗，并进行定期随访，术后第一年每三月随访一次，术后第二，三年每半年随访一次，以门诊或电话方式随访，随访内容为随访期间肿瘤复发或转移情况，对膀胱镜检及影像学有异常情况的患者进行组织活检病理学确诊，记录从术后至发生肿瘤复发或转移的时间为无进展生存时间。随访时间截止2022年3月。随访终点为随访结束或发生肿瘤复发或转移。

1.4 统计学分析 应用SPSS 22.0 软件处理数据。计量资料进行K-S 正态性检验，符合正态性分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用两独立样本t检验。不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位间距）[M（P25，P75）]表示，组间两两比较采用非参数Mann-whitneyU检验。计数资料以率(%)表示，组间率比较采用卡方检验。Kaplan-Meier 生存分析血清UBC1，DJ-1表达对NMIBC 患者无进展生存预后的影响。单因素及多因素COX 回归分析影响NMIBC 患者无进展生存预后的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清UBC1，DJ-1 表达比较 NMIBC组血清UBC1，DJ-1 表达分别为4.19±0.48，8.62±3.60 ng/ml，高于对照组血清UBC1，DJ-1 表达（1.27±0.29，4.31±1.07 ng/ml），差异具有统计学意义（t=43.300，12.117，均P＜0.05）。

2.2 血清UBC1，DJ 1 表达与NMIBC 患者临床病理特征的关系 见表1。肿瘤T1 期、高级别NMIBC 患者血清中UBC1，DJ-1 表达分别高于Ta/Tis 期、低级别患者，差异具有统计学意义(均P＜0.05）。不同性别、年龄、吸烟史、肿瘤直径和肿瘤数量比较，差异无统计学意义(均P＞0.05）。

表1 血清UBC1，DJ-1 表达与NMIBC 患者临床病理特征的关系[±s，M（P25，P75）]

表1 血清UBC1，DJ-1 表达与NMIBC 患者临床病理特征的关系[±s，M（P25，P75）]

类 别nUBC1 相对表达量t/ZPDJ-1（ng/ml）t/ZP年龄 （岁）＜60524.14±0.45 1.0200.310 8.29±3.89 0.8520.396≥60684.23±0.508.87±3.54性别 男性804.21±0.42 8.74±3.50 0.6750.501 0.8070.421女性404.15±0.538.18±3.75吸烟情况 是724.24±0.43 8.77±3.53 1.3500.179 0.5540.580否484.12±0.548.40±3.66肿瘤直径（cm） ≥3284.32（3.71，4.93）8.80（6.21，11.39）0.7480.213 0.4940.469＜3924.12（3.64，4.60）8.57（6.03，11.11）肿瘤数量 单发774.13±0.47 8.44±3.50 1.6810.095 0.7400.461多发434.29±0.558.94±3.64 TNM 分期 Ta/Tis 期813.79±0.43 7.34±3.04 15.3140.000 5.9960.000 T1 期395.21±0.5611.28±3.98肿瘤分级 低级别753.64±0.44 7.49±3.23 16.3930.000 4.5840.000高级别455.11±0.5310.50±3.87

2.3 血清UBC1，DJ-1 表达与NMIBC 患者无进展生存预后的关系 见图1。120 例NMIBC 患者随访期间，肿瘤进展39 例，3年无进展生存率为67.50%（81/120）。UBC1 高表达组和低表达组患者的平均无进展生存时间分别为28.17±3.68 个月，33.59±3.32 个月。UBC1 高表达组患者累积无进展生存时间低于UBC1 低表达组患者，差异具有统计学意义（Log-Rank testχ2=6.681，P＜0.05）。DJ-1 高表达组和低表达组平均无进展生存时间分别为27.34±3.29 个月，34.27±3.54 个月。DJ-1高表达组患者累积无进展生存时间低于DJ-1 低表达组患者，差异具有统计学意义（Log-Rank testχ2=11.262，P＜0.05）。

图1 K-M 生存曲线分析血清UBC1，DJ-1 表达与无进展生存预后的关系

2.4 单因素及多因素COX 回归分析影响NMIBC 患者无进展生存预后的因素 见表2，3。以TURBT术后是否发生进展为因变量(1=是，0=否，t=无进展生存时间)，将年龄（≥60 岁vs＜60 岁）、性别（男vs 女）、吸烟史（有vs 无）、肿瘤直径（＞3cm vs ≤3cm）、肿瘤数量（多发vs 单发）、肿瘤TNM 分期（T1 期vs Ta/Tis 期）、肿瘤分级（高级别vs 低级别），UBC1（高表达vs 低表达），DJ-1（高表达vs 低表达）为自变量，进行单因素COX 回归分析，将单因素分析中差异具有统计学意义的因素（P＜0.05）纳入及多因素COX 回归分析，结果显示，肿瘤分期T1 期、肿瘤分级高级别、UBC1 高表达、DJ-1 高表达是影响NMIBC 患者无进展生存预后的独立危险因素。

表2 影响NMIBC 患者无进展生存预后的单因素COX 回归分析

表3 影响NMIBC 患者无进展生存预后的多因素COX 回归分析

3 讨论

NMIBC 是肿瘤侵犯上皮或上皮下结缔组织，未侵犯肌层的膀胱癌，占初发性膀胱肿瘤的70%。NMIBC 的治疗以TURBT 联合术后膀胱灌注化疗为主，但即使经积极治疗后肿瘤仍然容易复发。目前NMIBC 患者治疗后随访主要以膀胱镜镜检，尿脱落细胞等为主。膀胱镜镜检是NMIBC 评估复发的金标准，但有一定的有创性。尿脱落细胞检查特异度高，但对于低级别膀胱癌诊断的敏感度较差。外周血炎症指标、尿液核基质蛋白22 及膀胱肿瘤抗原等也是非侵入性的用于膀胱癌早期诊断的标志物，但单一指标检测对膀胱癌复发诊断的敏感度和特异度不高[8]。因此，深入研究NMIBC 的疾病机制，寻找能够有效评估NMIBC 患者预后的血清生物标志物，有利于指导后续的个体化治疗方案，改善患者的临床预后。

长链非编码RNA（Lnc RNA）是长度超过200个核苷酸的非蛋白编码RNA 分子，可位于细胞核或细胞质中。近年来发现，Lnc RNA 通过调控基因组重塑、染色质修饰和基因转录后修饰，参与细胞凋亡、细胞周期、侵袭和增殖等生物学过程[9-10]。UBC1 作为一种Lnc RNA 的转录长度为2 616bp，位于染色体1q32.1 上，其在结直肠癌等肿瘤中表达上调，促进肿瘤细胞增殖、侵袭及转移，导致肿瘤患者不良预后[4-5]。本研究中，NMIBC 患者血清中UBC1 表达升高，并且与肿瘤TNM 分期及肿瘤分级有关，提示血清UBC1 水平受NMIBC 疾病影响。NMIBC 中UBC1 的表达升高的机制可能与UBC1 基因的转录调控失调有关。8 号染色体短臂的丢失是NMIBC 等尿路上皮癌发生的重要机制，结果导致转录因子锌指蛋白703 等癌基因的过度表达[11]。WANG 等[12]报道，胶质瘤中转录因子锌指蛋白703 结合UBC1 基因启动子，在转录水平促进UBC1 的表达，促进胶质瘤细胞的恶性增殖和侵袭。有学者发现，在58.8%的膀胱癌组织中UBC1表达升高，这与本研究结果中NMIBC 患者血清UBC1 水平升高一致[13]。另外，在膀胱癌肿瘤细胞系T24,5637 中发现，UBC1 能够与多梳蛋白抑制复合物2 结合形成复合物，促进组蛋白H3K27me3 修饰，诱导癌基因的表达，增强膀胱癌细胞的侵袭、淋巴转移及集落形成能力[13]。因此，我们提出假说，NMIBC 患者血清UBC1 水平升高能够促进NMIBC的肿瘤发病和进展，进而导致患者不良预后。本研究中证实，UBC1 高表达的NMIBC 患者无进展生存预后较差，并且UBC1 高表达是影响NMIBC 患者无进展生存预后的独立因素，提示血清UBC1 是一种新的NMIBC 预后相关肿瘤标志物。ZHANG等[14]学者对膀胱癌患者血清外泌体LncRNA 表达谱进行分析，发现相比于尿脱落细胞学检测，基于UBC1，PCAT-1 和SNHG16 的组合模型能够更为有效评估膀胱癌术后复发，诊断的准确性达0.857。因此，UBC1 可能是一种理想的评估NMIBC 患者预后的血清标志物。临床泌尿外科医生可根据UBC1 的表达水平，对NMIBC 患者TURBT 术后是否发生肿瘤复发进展进行评估，对于高危复发进展的患者，予以积极化疗或卡介苗膀胱灌注免疫治疗，以改善患者临床预后。

DJ-1 是一种帕金森病相关蛋白，又称PARK7，表达于人体多种组织中，具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡及抗氧化等多种功能[15]。研究表明，DJ-I 可与p53，磷酸酶张力蛋白同源物基因等多个抑癌基因相互作用，参与恶性肿瘤的发生发展[7,16]。本研究中，NMIBC 患者血清DJ-1 表达明显升高，并与肿瘤TNM 分期及肿瘤分级有关，提示NMIBC 能够影响血清DJ-1 水平。与SOUKUP等[17]在尿液中发现DJ-1 表达上调结果一致。但该研究尿液DJ-1 对NMIBC 诊断的敏感度和特异度较低（61%，67%），其原因是低级别、低分期的膀胱癌肿瘤细胞DJ-1 表达量较低，并且其结果受到肾功能和尿量的影响。因此，血清DJ-1 水平可能是理想的NMBIC 血清肿瘤标志物。NMIBC 中DJ-1 的表达可能与微小RNA 介导的转录后调控异常有关。研究表明，微小RNA-203 能够结合并抑制DJ-1 mRNA 的表达，肿瘤发生时微小RNA-203 表达异常降低，导致DJ-1 mRNA 稳定性增加，导致DJ-1 蛋白表达增加，进而抑制肿瘤细胞的凋亡[18]。膀胱癌中由于10 号染色体杂合性缺失，导致磷酸酶张力蛋白同源物基因等抑癌基因的失活。LEE等[19]发现，DJ-1 的表达升高通过抑制磷酸酶张力蛋白同源物基因的表达，激活磷脂酰肌醇3 激酶/Akt 信号通路，促进肿瘤细胞的恶性增殖和转移。此外，DJ-1 的表达升高可通过促进结直肠癌肿瘤细胞中细胞周期蛋白D1 的表达，抑制p53-Bax 抗凋亡途径，促进肿瘤的过度增殖和转移，导致肿瘤分期增高[20]。因此，我们推测NMIBC 患者血清DJ-1表达升高可导致患者不良预后。本研究通过生存分析证实，DJ-I 高表达的NMIBC 患者无进展生存预后较差，是影响患者无进展生存预后的独立危险因素，提示血清DJ-1 可能是新的评估NMIBC 预后的生物标志物。DJ-I 高表达导致NMIBC 患者不良预后的原因可能与DJ-1 参与促进抗肿瘤药物耐药性形成有关。有学者报道，DJ-1 可通过激活细胞外信号调节激酶/RAS 信号通路的激活，增强肿瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼耐药性的形成[7]。NMIBC 患者TURBT 术后常规予以膀胱灌注化疗，以预防肿瘤复发。WANG 等[21]报道，结直肠癌中DJ-1 通过活化核因子κB/Snail 信号通路，诱导肿瘤细胞上皮间质转化，促进肿瘤细胞对奥沙利铂、5-氟尿嘧啶等化疗药物耐药性形成。因此，DJ-I 是一种新的NMIBC 预后相关肿瘤标志物，以DJ-1 为靶点的临床治疗可能通过增加术后膀胱灌注化疗治疗的敏感度，改善患者的无进展生存预后。

综上所述，NMIBC 患者血清UBC1 和DJ-1 表达升高，两者表达与肿瘤TNM 分期、肿瘤分级有关。血清UBC1 和DJ-1 高表达的NMIBC 患者无进展生存预后较差，是影响患者无进展生存预后的独立危险因素。临床医生可根据血清UBC1，DJ-1 表达水平，对患者接受TURBT 治疗后的预后进行评估，对于高危进展的NMIBC 患者及时采取有效措施进行预防，以改善患者的临床预后。但本研究尚存在一定的不足，本研究样本量有限，未对NMIBC 患者TURBT 术后血清UBC1，DJ-1 水平变化进行动态分析，有待今后设计多中心、大样本及前瞻性的临床实验进一步验证。