外周血单个核细胞及移植活检组织中他克莫司浓度与全血浓度和不良反应及临床疗效相关性研究进展*

郭朋朋,张蕊,刘亚妮,师少军,2

[1.华中科技大学同济医学院附属协和医院药学部,武汉 430022;2.武汉市江夏区第一人民医院(协和江南医院)药学部,武汉 433000]

第2代钙调磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitor,CNI)他克莫司(tacrolimus,TAC),作为器官移植术后预防排斥反应的重要免疫抑制剂,由于治疗窗窄和较高的药动学变异性,临床常常需要以治疗药物监测(therapeutic drug monitoring,TDM)调整个体用药剂量[1]。尽管器官移植受者一定程度上受益于TDM,但存在新的临床问题:全血TAC在治疗窗内,仍然发生排斥反应[2]。事实上,TAC经肠道吸收后,主要分布在红细胞内(约85%),14%分布在血浆中,一小部分(<1%)进入含有淋巴细胞的外周血单个核细胞中[3]。TAC靶向作用于T淋巴细胞,通过与细胞溶质受体FKBP12结合抑制钙调神经磷酸酶的活性,阻断活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)去磷酸化和核转位,抑制细胞因子表达以及抑制淋巴细胞活化,从而降低免疫反应。研究表明,患者性别、年龄、红细胞沉降率[4]、细胞色素P450(CYP3A4、CYP3A5)、药物转运体(ABCB1)基因多态性等因素均可影响全血TAC浓度[5],从而导致个体间差异。基于TAC的TDM临床应用存在的问题以及全血TAC在个体间较大差异:血药浓度的监测并不能准确反映其在体内靶细胞的分布情况。研究者们提出检测淋巴细胞和移植组织内TAC浓度以替代全血浓度,以达到精准监测的目的,从而实现临床TAC个体化用药。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells ,PBMCs)作为一种易于获取的基质,已用于研究淋巴细胞内TAC浓度[6]。除此以外,同种异体移植物组织活检样本也作为TAC的TDM潜在辅助基质进行类似的研究[7]。本综述主要阐述血液、PBMCs以及移植物中TAC浓度的相关性,以及其与钙调磷酸酶活性、排斥反应及TAC相关肾毒性之间相关性,为浓度-药效提供证据,从而达到临床个体化用药的目的。

1 PBMCs、移植活检组织中TAC浓度与全血浓度相关性

上述研究均表明PBMCs内TAC浓度与全血TAC浓度之间存在有限的相关性,这可能是由于患者体内PBMCs组成改变、患者性别、红细胞沉降率、体内代谢酶CYPs及转运体ABCB1基因多态性等因素[21-22]对TAC在体内的分布与处置产生影响。因此,在对PBMCs与全血TAC浓度进行相关性分析时,应将上述因素纳入考虑以减少个体间变异性。

1.2移植活检组织中TAC浓度与PBMCs、全血浓度相关性 早期CAPRON等[9]对90例肝移植患者中肝组织内TAC浓度进行检测分析,结果发现肝内C0与全血稳态浓度并无相关性,但发现PBMCs内TAC浓度与肝内浓度在移植后第5天后开始相关(P<0.05)。但之后BODNAR-BRONIARCZYK等[23]研究发现,全血TAC浓度与肝脏或肾脏器官中TAC浓度之间不存在相关性(P=0.151 9,n=50;P=0.391 8,n=50)。与NOLL等[24]报道结论一致,肾脏组织TAC 浓度的变化似乎反映血液中的变化,但当日全血TAC和肾脏TAC浓度之间并没有相关性。ZHANG等[25]观察到52例患者肾移植后3个月TAC组织浓度和全血浓度之间具有相关性(n=52,r=0.356 0,P=0.009 6),而在1年后并未发现两者之间存在关联性(n=22,r=0.336 8,P=0.125 3)。SALLUSTIO等[26]在该研究中,对132例肾移植患者口服TAC剂量、全血TAC浓度及组织TAC浓度进行相关性研究,结果发现口服剂量与全血浓度(r=0.15,P=0.048)、口服剂量与组织浓度(r=0.41,P=5.8×10-9),以及全血浓度与组织浓度(r=0.44,P=7.4×10-10)存在显著正相关。

以上试验均显示全血TAC浓度与组织内TAC浓度之间具有较弱的相关性,研究人员从多方面来解释可能的机制及原因。根据目前对免疫抑制治疗期间药物遗传学的研究,在肝移植患者中发现CYP3A5基因型与TAC剂量需求之间的关联是一致的[27-28];另一方面,TAC在移植组织中分布将受到药物转运体表达和多态性的密切调节,如ABCB1的活性和表达水平可能导致TAC吸收和排泄的变异性[29-30],甚至更可能影响TAC在同种异体移植物中的组织分布和药物效应或毒性[27,31-33]。由于试验中无法确保所有活检组织均为同一位置,以及无法排除器官移植后发生缺血-再灌注损伤从而影响CYP3A5表达差异[34-35],供受体基因多态性[36]、代谢酶与转运体在肾、肝及其他器官中表达活性差异,因此两者之间相关性较差。

2 PBMCs、移植组织中TAC浓度与排斥反应相关性

2.1PBMCs内TAC浓度与排斥反应相关性 随着PBMCs内浓度检测方法的开发,研究者同时聚焦于PBMCs内TAC浓度是否可直接预测临床排斥反应的发生。CAPRON等[9]发现,90例肝移植患者术后,与无至轻度组织学排斥反应(BANFF评分<6)的53例患者比较,出现中度至重度排斥反应(BANFF评分>6)的37例患者在术后第3,5,7天时PBMCs内TAC浓度显著降低,在第7天时肝内TAC浓度同样显著性下降,而这两组在全血浓度上并没有表现出差异,即在术后第7天移植患者肝内和PBMCs内TAC浓度与BANFF评分呈显著相关,相关系数r分别为0.720 3,0.900 3,而平均血药浓度与BANFF评分无关。LEMAITRE等[17]报道1例患者发生急性排斥反应,该患者在第1,7天时PBMCs内TAC浓度较其他9例未出现排斥反应患者低约4倍,而全血TAC AUC0-12h接近平均值(分别为81.3,70.0 nghmL-1)。FRANCKE等[15]在175例肾移植患者发现,随着移植术后时间延长,虽然全血与PBMCs内TAC浓度相关性在改善,但全血TAC或PBMCs内TAC在移植后第3个月时,与临床排斥反应的发生均无关。随后,2022年研究中详述PBMCs内浓度、CD3内浓度、CD14内浓度与有无发生排斥反应均无关联[20]。

尽管检测PBMCs内TAC浓度作为临床TDM的补充,但前述无论是肝移植、肾移植甚至心脏移植患者,其体内PBMCs内TAC浓度与临床排斥反应或组织学结果相关性较弱或无相关性,只有1例肝移植患者在发生急性排斥反应时其体内PBMCs内TAC浓度较其他未发生患者低。

2.2移植组织中TAC浓度与排斥反应相关性 SANDBORN等[37]提出实体器官移植后同种异体移植物的原位免疫抑制剂可能比全身免疫抑制更重要。在其开展的临床试验中显示,与9例肝移植术后发生早期细胞排斥反应的患者比较,10例无排斥反应患者肝组织中TAC的中位数显著升高。肝组织中TAC浓度<100 ng·g-1对细胞排斥反应的敏感性为78%,特异性为72%。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)用于分析移植组织中TAC浓度越来越多。CAPRON等[38]建立LC-MS/MS法来准确定量测定肝移植组织中TAC浓度,该方法线性范围为5～500 pg·mg-1组织。在术后第7天对146例患者进行全血(酶免疫)及移植组织中TAC浓度的检测,未发生或发生轻度排斥反应(BANFF评分<6,n=67)患者全血TAC浓度与中重度排斥反应(BANFF评分>6,n=79)比较,全血浓度无差异的情况下肝组织中浓度显著下降。BANFF评分与肝内TAC浓度之间存在一级指数相关性(r2=0.98,P=0.002)。BODNAR-BRONIARCZYK等[23]对肝、肾移植组织中TAC进行分析定量。结果显示:在肾移植患者中,未发生或轻度排斥反应患者(n=43)活检组织TAC浓度为(88.9±41.3) pg·mg-1,中度至重度排斥反应患者(n=7)为(23.1±8.1) pg·mg-1;全血浓度分别为(7.1±1.9) ,(7.8±2.1) ng·mL-1;在肝移植患者中,未发生或轻度排斥反应(n=44)患者活检组织TAC浓度为(109.2±45.7) pg·mg-1,中度至重度排斥反应患者(n=6)为(28.3±7.8) pg·mg-1;全血浓度分别为(7.4±2.3),(6.9± 1.7) ng·mL-1(P<0.001)。可得出低TAC浓度与BANFF评分>6之间的关系具有统计学意义(肝移植患者:P=0.006 9;肾移植患者:P=0.002 1)[23]。这与CAPRON等[9]结论一致,发生排斥反应肝移植患者活检组织中TAC浓度低于未发生者(P<0.05),而全血差异无统计学意义,即肝内TAC与全血水平无相关性,排斥反应严重程度与肝内TAC浓度相关。但ZHANG等[25]未发现肾移植组织内TAC浓度或者组织浓度/全血浓度比值与经活检证实的急性排斥反应具有关联。SALLUSTIO等[26]再次验证肾组织TAC浓度与排斥反应之间没有关联。在ZHANG与SALLUSTIO[25-26]两项研究中,患者联用TAC、霉酚酸及泼尼松龙以达到免疫抑制,分别有21%,44%移植患者发生排斥反应。这些结果与之前的肝移植结果形成对比,即肾组织内TAC浓度与急性排斥反应的发生没有相关联系。

在肝移植患者中表现出移植组织浓度与排斥反应的相关性,这在肾移植患者中未观察到。主要原因在于上述研究中肝移植患者仅接受TAC单药治疗,中度至重度排斥反应发生概率较高,而肾移植患者均接受TAC、霉酚酸、类固醇三联疗法来达到免疫抑制治疗。主要说明TAC不能够完全抑制淋巴细胞的活化,间接证明三联疗法能够起到降低TAC相关不良反应且更好的免疫抑制作用。

3 全血、PBMCs内TAC浓度与钙调磷酸酶活性(CNA)相关性

钙调磷酸酶作为TAC最终药效学评价指标,目前关于该酶活性测定的方法主要有:酶联免疫吸附测定(ELISA)、超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)等。LEMAITRE等[17]对10例肝移植患者术后第1,7天全血TAC、PBMCs内TAC以及CNA进行PK-PD关系研究。第1天与第7天全血TAC与CNA AUC0-12 h无显著相关性(P=0.92,0.10);PBMCs 内TAC与CNA AUC0-12 h之间亦未发现相关性(P=0.71,0.88)。TRON等[16]对32例肝移植患者进行全血、PBMCs内TAC浓度及CNA进行测定,发现CNA与TAC全血或PBMCs内浓度均无关联,即PBMCs内TAC浓度与药效学关系在本研究中并未体现。HAN等[11]对214例肾移植患者稳定期全血TAC浓度与PBMCs内TAC浓度比值与T细胞活化之间的关系进行研究,结果发现PBMCs内TAC浓度与T细胞反应性程度密切相关。对于全血TAC浓度,相关性也是一致的,但与PBMCs内TAC比较,相关性不大。FONTOVA等[39]研究25例肾移植患者服用TAC后CNI和CNA的AUC与全血及PBMCs内TAC浓度关系,结果发现全血内TAC浓度和CNA之间存在显著相关性,而PBMCs内TAC浓度和CNA之间相关性未被调查。

通过上述研究可发现,全血内TAC及PBMCs内TAC浓度与CNA抑制作用或者淋巴细胞活化可能具有一定相关性,并且与全血比较,似乎PBMCs内TAC浓度与CNA或淋巴细胞活化关系更显著。因此,如何更精确检测PBMCs内CNA是目前亟待解决的问题。

4 全血、PBMCs、移植活检组织内TAC浓度与肾毒性相关性

TAC相关肾毒性是TAC常规使用的重要不良反应之一。HAN等[11]对214例肾移植患者进行回顾性研究,提出在移植后6个月内,PBMCs稳态浓度与肾毒性之间无显著相关性。FRANCKE等[15]发现52例在移植术后出现TAC相关肾毒性的肾移植患者与未发生肾毒性患者相比差异无统计学意义(两组全血TAC浓度中位数分别为7.3,7.8 ng·mL-1,P=0.38;PBMCs内TAC浓度中位数:26.5,27 pg·106cells,P=0.91)。这两组患者术后第3个月PBMCs/全血TAC比率同样差异无统计学意义。SALLUSTIO等[26]发现9例发生急性肾毒性移植患者活检组织中TAC浓度较未发生急性肾毒性移植患者高,即组织内高TAC与急性肾毒性的发生存在正相关。总之,目前临床证据表明PBMCs内TAC浓度在预测肾毒性方面应用价值不高,只有SALLUSTIO研究表明移植肾组织内高TAC浓度与肾毒性存在相关性,需要在前瞻性研究中得到确认。

5 结束语

综上所述,PBMCs内TAC浓度与全血TAC浓度进行相关性分析时,应将多因素(年龄、性别、CYPs、ABCB1等)纳入考虑。仅有一项临床试验表示PBMCs内TAC与移植活检组织中TAC浓度对术后急性排斥反应具有很强预测性,尚未在其他肝脏移植临床试验中被重复,因该研究中患者采用TAC单药作为免疫抑制,已不适用于目前临床应用。一些研究说明PBMCs内TAC浓度与T细胞活化/CNA之间的显著相关性,有关靶细胞内CNA的准确检测是目前TAC药效学评价的难点。仅有一项研究报告肾移植组织TAC浓度与急性肾毒性具有相关性,但由于急性肾毒性发生概率太小,需要在大样本研究中进行验证。尽管针对PBMCs内及移植组织中免疫抑制剂浓度的研究已然深入至代谢酶CYP3A4、3A5、转运体ABCB1等基因多态性、红细胞压积、性别、口服剂量等,但其作为临床预测急性排斥反应或肾毒性的临床意义具有局限性。并且,大多数临床研究均由于回顾性、样本量较小、统计能力不足等限制,结果都存在一定局限性。因此,需要设计多中心、多样本量的前瞻性临床研究以确定PBMCs内或移植组织内TAC浓度是否比当前临床TDM具有更加显著的临床意义。群体药动学[40-41]模型作为一种稳定策略可作为目前临床剂量选择的参考方式,可以同时评估显著的协变量因素,如红细胞沉降率、性别及其他可影响TAC代谢转运等,已达到个体化给药的临床目的。