CRISPR-Cas技术在病原体核酸检测中的研究进展*

张咪咪 综述,刘家云,2△ 审校

1.陕西中医药大学医学技术学院,陕西咸阳 712000;2.第四军医大学西京医院检验科,陕西西安 710032

感染性疾病的病原体种类繁多,临床最常见的有病毒和细菌等,它们具有易变异,致病性强,传播速度快等特点,严重威胁人类健康[1]。目前全球感染性疾病的现状不容乐观,尤其是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染暴发流行,凸显了病原体的早期快速检测对临床诊断、预后判断,以及指导用药、控制传播的重要性[2]。传统的病原体检测方法包括直接镜检、病原体分离与培养、抗原-抗体检测、聚合酶链式反应(PCR)等。目前实验室最常用的核酸检测技术是PCR,尽管其灵敏度高、特异性好,但存在实验耗时长、检测成本高,对实验室环境、人员和设备要求高等不足[3]。因此,迫切需要开发出更简便、快速的新型核酸诊断方法。近年来,基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas)的发现和深入研究给研究者带来了希望[4-5]。2016年ABUDAYYEH等发现[6],Cas12具有“附带切割”活性,即识别并结合到靶序列之后,Cas蛋白除可以特异性切除靶序列外,还会非特异性地切割荧光报告探针,释放荧光信号,可以此达到检测目的。此后,基于CRISPR-Cas的核酸检测技术成为重要的研究方向之一。本文旨在对Ⅱ类CRISPR-Cas系统及其在感染性疾病核酸检测方面的应用现状进行综述。

1 CRISPR-Cas系统概述

1.1CRISPR-Cas系统及分类 CRISPR-Cas系统是原核生物的一种RNA引导的适应性免疫系统,包括重复序列与间隔序列交替出现的CRISPR序列及Cas蛋白,其通过在细菌宿主染色体中以病毒DNA的形式储存记忆来阻止噬菌体感染[7-8]。该系统通过适应、成熟、干扰3个阶段发挥免疫功能。第一阶段,当噬菌体或者病毒入侵时,细菌免疫防御机制激活,Cas蛋白剪切入侵基因的特定序列并将其整合到CRISPR序列中,以便再次入侵时能快速识别;第二阶段,间隔序列翻译成包含入侵序列的CRISPR核糖核酸(crRNA)和反式激活RNA (tracrRNA),二者通过碱基配对形成向导RNA(sgRNA),用于募集Cas蛋白;第三阶段,当外源物再次入侵时,sgRNA与Cas蛋白结合成复合物,sgRNA通过序列互补捕捉靶标,Cas蛋白则发挥内切酶活性进行切割,并在前间隔序列邻近基序(PAM)的协助下,清除外来遗传物质,发挥其免疫作用[9]。

Cas蛋白是具有目标依赖性的核酸酶,可由单个蛋白或者蛋白复合物组成。根据不同的Cas蛋白,将CRISPR-Cas系统分为两大类、6种类型、33种亚型和若干变种[10]。Ⅰ类系统由Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型组成,主要依赖由多个Cas蛋白和crRNA组成的复合物;Ⅱ类系统包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型,与Ⅰ类系统相比,Ⅱ类系统的效应复合物是一个与crRNA结合的单一Cas蛋白[11]。由于Ⅱ类的CRISPR-Cas系统具有简单且高效的特点,因此被广泛应用于基因编辑和分子诊断领域。CRISPR介导的适应性免疫和一系列的Cas蛋白的发现和深入研究,不仅引领了基因编辑的变革,还推动了核酸检测方法不断推陈出新[12]。

1.2CRISPR-Cas系统核酸检测原理 CRISPR-Cas系统起初作为微生物、动植物系统中基因组编辑的有效工具,已逐渐成为传统方法锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)等基因编辑方式的潜在替代品[13-14]。2012年MARTIN等[15]首次报告了CRISPR-Cas9系统的基因组编辑潜力及其切割双链DNA(dsDNA)的能力,并于2013年首次作为编辑基因组的工具应用于哺乳动物细胞。目前关于基因组编辑的研究主要集中在病毒感染、心血管疾病(CVDs)、代谢紊乱、免疫系统缺陷、血友病等方面[16]。近年来,Cas13a(以前称为C2c2)和Cas12a(以前称为Cpf1)的RNA引导的核酸酶活性推动了新的核酸检测工具的开发。基于CRISPR-Cas的核酸检测技术主要是利用不同Cas蛋白的核酸酶活性。Ⅱ类Cas蛋白在核酸检测中广泛应用,其原理也有所不同。其中,Cas9以基因编辑闻名,也可用于核酸检测,它有2个结构域HNH和RuvC,且依赖3′端富含GC的PAM序列,通过sgRNA结合Cas9后识别并裂解dsDNA发挥其核酸酶活性[17]。Cas12a的结构域为单个RuvC,依赖的PAM序列5′端富含AT,可以在crRNA的介导下识别并切割dsDNA,然后通过激活的“附带切割”活性非特异性切割单链DNA(ssDNA)[18]。Cas13a靶向RNA且具有2个HEPN结构域,其依赖的原间隔子侧翼位点(PFS) 3′端可以是A、U或C,Cas13a一旦识别并切割由crRNA序列识别的RNA靶标,就转入了一种酶促“激活”状态,将结合并切割其他的RNA,而不管是否与crRNA同源,或是否存在PFS[19]。最近发现的Cas14是一种靶向ssDNA的核酸酶,且体积比Cas9小1/2,可以在sgRNA引导下不依赖PAM发挥酶切作用[20]。上述几种CRISPR-Cas系统的主要特征见表1。

2 CRISPR-Cas技术在感染性疾病核酸检测中的应用

2.1CRISPR-Cas9 Cas9自被发现以来,除了作为基因编辑中普遍使用的酶之外,也越来越广泛地应用于感染性疾病的诊断[21]。将其裂解功能与核酸扩增相结合,可检测特异性核酸序列,用于病原菌基因分型和单核苷酸多态性(SNP)鉴别。2016年,PARDEE等[22]将Cas9和核酸依赖扩增技术(NASBA)结合,借助Toehold生物传感器建立了可肉眼判读寨卡病毒检测结果的平台(NASBACC)。该平台利用NASBA对目标RNA的高效扩增和CRISPR-Cas9可特异性识别靶标的优势,可在3 h内鉴别寨卡病毒并对其进行基因分型。指数扩增反应(EXPAR)是一种快速的等温扩增技术,但是和其他核酸扩增方法一样存在非特异性扩增。2018年HUANG等[23]将CRISPR-Cas9与EXPAR联合起来开发了Cas-EXPAR检测系统,用于李斯特菌的快速超敏检测,该系统首先由CRISPR-Cas9切割产生目标DNA片段,然后通过EXPAR产生大量DNA,并通过实时荧光监测方法检测,它结合了CRISPR-Cas9和指数扩增的优点,可以精准识别并切割目标,解决了EXPAR非特异性扩增的问题,提高了检测的特异性和效率。

上述2个平台都利用了Cas9特异性切割靶蛋白的特性,除Cas9之外,核酸酶失活的Cas9(dCas9)也被应用于感染性疾病的诊断,不同的是研究者通过对Cas9的2个核酸酶结构域进行突变,使其失去剪切能力但可以特异性结合靶蛋白[24-25]。基于此,GUK等[26]开发了一种基于DNA荧光原位杂交(FISH)的CRISPR传感技术,FISH已广泛应用于研究和诊断,可达到可视化结果的目的。该技术使用dCas9-sgRNA复合物作为靶标,通过特异性识别与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中与甲氧西林抗性有关的mecA来捕获MRSA的基因组,因为大多数对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)的DNA菌株不含mecA基因,因此可用于检测MRSA,通过荧光染料显色来达到可视化的效果,且荧光强度可以反映MRSA的浓度。重要的是,通过简单地改变sgRNA序列,本方法可以应用于MRSA以外的任何目标序列。ZHANG等[27]开发一种RNA引导的成对dCas9(PC)报告系统,用于结核分枝杆菌的检测。该系统中的2个dCas蛋白分别与一分为二的荧光素酶相连,当2个dCas9同时识别并结合到靶标时,分开的两部分荧光素酶会被拉近产生增强的荧光信号,以此来达到检测目的。

上述这些技术所用的生物传感器构建过程相对复杂、需要一对Cas9/sgRNA、昂贵的荧光探针等成本较高,这阻碍了其广泛应用,特别是在即时检测(POCT)中。基于此WANG等[28]开发一种快速、准确、便携的核酸检测平台,最大限度地减少对设备和专业技术人员的依赖,该技术的核心是将CRISPR-Cas9识别集成到侧向流动检测(LFA)平台中,称为CRISPR-Cas9介导的侧向流动核酸测定法(CASLFA),可在1 h内检测鉴定产单核细胞李斯特菌、转基因生物和非洲猪瘟病毒等。

表1 Ⅱ类CRISPR-Cas系统的主要特征

2.2CRISPR-Cas13 在CRISPR-Cas家族中,Cas13a是一种RNA引导的核酸酶,属于Ⅵ型CRISPR-Cas系统,可以在crRNA引导下特异性结合ssRNA,2016年被发现具有强大的“附带切割”活性。张锋团队开发了第一个基于CRISPR-Cas13a的核酸检测系统SHERLOCK,该系统使用重组酶聚合酶扩增(RPA)对靶标进行扩增,极大地提高了检测的灵敏度,并在体系中加入荧光报告基团,通过产生可定量检测的信号,实现标本DNA和RNA的单碱基分辨率检测,该系统已经成功应用于检测寨卡病毒和登革病毒等[29]。2018年,GOOTENBERG等[30]开发了一种使用Cas13、Cas12a和CRISPR辅助相关酶Csm6的多路复用便携式核酸检测平台,称为SHERLOCK version 2(SHERLOCK v2),与一代平台相比有以下优点:(1)将Cas13a与Csm6联合使用增强信号,使检测灵敏度提高了3.5倍;(2)将等温扩增时需要的引物稀释后加入体系,避免了荧光报告基团饱和;(3)建立了基于LFA的便携试纸条;(4)可实现了四通道多重检测,这些优势使得SHERLOCK v2的应用更加便捷和广泛。之后,MYHRVOLD 等[31]开发出HUDSON法,通过将病毒颗粒裂解和核糖核酸酶失活的热处理及化学处理与SHERLOCK相结合,可以在不经 DNA/RNA 提取和纯化步骤的情况下裂解病毒,使SHERLOCK可以直接从临床标本中检测病毒核酸,极大地简化了操作步骤。ARIZTI-SANZ等[32]将HUDSON进行优化开发出SHINE法,其可以加速标本中的病毒失活,极大提高了诊断能力。

2020年SARS-CoV-2迅速传播并导致全球大流行,虽然可以使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)来诊断SARS-CoV-2感染,但由于试剂和设备的不足,在一定程度上减慢了疾病检测的速度[33]。为了帮助推进SARS-CoV-2感染的诊断,JOUNG等[34]开发了一种基于SHERLOCK技术检测SARS-CoV-2的方案,通过使用合成的SARS-CoV-2 RNA片段,能够在1 h内完成10-18mol/L的SARS-CoV-2靶序列检测。

2.3CRISPR-Cas12 除了Cas13,基于Ⅱ类V-A型Cas12a也被发现具有“附带切割”活性,然而与Cas13不同的是,Cas12a靶向DNA并“附带切割”侧支的ssDNA[35]。基于这一特性,CHEN等[36]将Cas12a与等温扩增结合起来建立了DETECTR平台,可以准确快速检测HPV16和HPV18 2种高危类型的人乳头瘤病毒(HPV),这对于识别有相关癌症风险的人群至关重要。与此同时,LI等[37]开发了HOLMES快速核酸检测系统,该平台在Cas12a、crRNA和靶核酸形成复合物后,Cas12a的反式切割活性被激活,ssDNA报告基因被切割成小片段,报告基因可以用荧光物质或生物素标记并通过生物传感器达到可视化。目前的方法中,核酸扩增和基于CRISPR-Cas的靶标检测是两个独立的步骤,需要将扩增产物与Cas检测系统混合后进行,这会造成实际应用的不便且标本间存在潜在交叉污染的可能。因此后续研究者在DETECTR的基础上开发出了一种称为Cas12aVDet的检测方法,该方法通过将等温扩增和Cas12a切割反应整合在一个系统中,减小了污染的可能,缩短了检测时间[38]。BROUGHTON等[39]开发了一种快速检测SARS-CoV-2的DETECTR方法,该方法具有等温信号放大系统,不需要热循环,检测时间短,单核苷酸靶标特异性,可视化侧向流动条集成,不需要复杂的实验室基础设施等优点,经验证,DETECTR检测SARS-CoV-2的准确性与RT-qPCR相当,提示该技术可以为传统检测提供一种更加便捷、可视化的新方法。AI等[40]利用Cas12a建立了一种快速检测临床标本中结核分枝杆菌的方法,称为CRISPR-MTB,与Xpert方法相比,CRISPR-MTB具有接近单拷贝的高灵敏度,需要的样品更少,并且检测周期更短。

除了Cas12a之外,Cas12b也被发现具有相同的“附带切割”活性[41]。LI等[42]将CRISPR-Cas12b和环介导等温扩增(LAMP)联合起来创建了改进版的HOLMESv2,结合了Cas12b的48 ℃高温耐受性和LAMP可在42～65 °C达到60 min快速扩增的优点,该系统可区分SNP,并将核酸扩增和目标检测步骤整合到一个体系中,简化了操作程序并避免交叉污染。2019年TENG等[43]通过优化sgRNA,开发了基于Cas12b的DNA检测方法(CDetection),这与之前报道的基于Cas12a的检测平台相比具有更高的灵敏度和特异性,为DNA检测提供了一个高效且实用的平台。之后,GUO等[44]通过将标本处理和核酸扩增方法与CDetection相结合,建立了一个集成的病毒核酸检测平台CASdetec(即CRISPR辅助检测),该平台将病毒处理、核酸扩增和基于CRISPR的检测等程序在一个试管中运行,不需要打开盖子即可在可见光下肉眼判读结果,具有防止气溶胶污染及降低假阳性率的优点。CHEN等[45]基于CRISPR-Cas12b设计了一个乙型肝炎病毒(HBV)检测平台,称为CRISPR-HBV,可对临床上2种主要的HBV基因型(HBV-B 和 HBV-C)进行超灵敏、高特异性和快速检测。

2.4CRISPR-Cas14 最近,发现了一种新的CRISPR-Cas14系统,其中Cas14a可不依赖PAM特异性靶向ssDNA且体积更小,这使得Cas14a成为DNA检测的另一个优秀候选者。SAVAGE[46]在DETECTR的基础上,将Cas12a替换成Cas14a,开发了Cas14-DETECTR系统,该系统结合等温扩增通过RPA和Cas14a高效检测DNA,可诱导切割与荧光报道分子偶联的ssDNA序列产生荧光信号。这种新的诊断技术已经被证明可以准确检测人类E3泛素蛋白连接酶(HERC2)基因,具有更强的特异性和“附带切割”活性[47]。

3 CRISPR-Cas技术在病原体核酸检测中的优势与局限

与传统的诊断方法相比,CRISPR-Cas系统为病原体核酸检测提供了新的思路。许多基于CRISPR的核酸检测方法简单便携,不需要经过严格培训的人员及专门仪器和设备,检测时间短,读取结果简单,灵敏度高,并且能够满足POCT的需要,还可以检测未经处理的和浓度极低的标本,这表明基于CRISPR-Cas技术的核酸检测有广阔的应用前景[48]。部分基于CRISPR-Cas建立的核酸检测平台及其特点见表2。目前,传统方法依然在临床病原微生物的检测方面发挥着重要作用,作为新兴技术的CRISPR-Cas在核酸检测中的优势在于核酸扩增后的进一步信号放大和信号转化及输出,尤其是Cas蛋白特异性识别扩增产物后所激活的“附带切割”活性[49]。

然而,CRISPR-Cas技术也存在局限性:(1)序列限制。sgRNA正确识别靶标位点需要PAM序列,虽然这在某种程度增加了系统的特异性,但也降低了靶标区域选择和sgRNA设计的灵活性;此外,不同种类的CRISPR类型和物种具有不同的PAM序列,这也使sgRNA的设计更复杂化。(2)定量分析。对于CRISPR-Cas13a检测系统,SHERLOCK平台以其极高的灵敏度而备受青睐,然而,SHERLOCK在反应开始后会迅速饱和,这使得实时准确定量非常困难,对于分子诊断,定量分析非常重要,且对于多种疾病来讲定量可能是诊断所必需的,这就需要做更多的探索来寻找量化的方法[50]。(3)多重检测。由于信号采集策略的限制且多个检测步骤之间可能会存在干扰和交叉反应,从而影响了灵敏度和特异性,所以多重检测仍具有相当的挑战性。(4)标准化。离子水平、环境温度、pH值等许多因素可能会干扰效应蛋白的裂解活性,从而使产生的信号发生变化,造成结果不准确,因此检测系统的标准化就显得更加重要[51]。

表2 基于CRISPR-Cas的核酸检测平台

4 总结与展望

近年来,CRISPR-Cas系统因为其高效性、便携性和低成本的优点,在基因组编辑方面有巨大贡献,使得临床疾病的诊断和治疗发生了革命性的变化。自其“附带切割”活性被发现之后,基于CRISPR-Cas系统检测病原体核酸也进入高速发展期,开发的病原体检测平台逐步成为临床中的有用工具。作为一个迅速兴起的新技术,CRISPR-Cas9技术已经被用于操作培养细胞、编辑动物和植物的基因组,极大地加快了基础研究的步伐,也使得农业和合成生物技术取得突破性进展,目前也逐步进入一个新的时代,可尝试将基因编辑技术用于患者体内的致病基因的失活或修正,这将为遗传性疾病患者提供一种全新的治疗方案[52]。对于在2016-2019年基于Ⅱ型CRISPR-Cas系统开发出的众多平台,通过不断衍生发展,目前可以实现对包括寨卡病毒、疟原虫、HPV、伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒、非洲猪瘟病毒、SARS-CoV-2、HBV、人类免疫缺陷病毒(HIV)、登革热病毒、结核分枝杆菌等病原体的高效和特异性检测。同时,CRISPR-Cas技术也可用于发现新的疾病治疗靶点和检测生物标志物,这为肿瘤的早期诊断以及临床治疗提供了更加准确的科学依据和方法。目前临床各种类型的耐药越来越严重,包括对我国乃至全世界造成重要疫情的结核病,因此可以将CRISPR-Cas技术应用于临床细菌耐药性检测中,这对于缓解结核菌耐药现状,以及临床常见的耐药细菌感染至关重要。

综上所述,CRISPR-Cas技术目前仍处于起步发展阶段,在基于CRISPR的核酸检测能够完全取代PCR等已建立的核酸检测技术之前,仍然面临诸多挑战。但是,基于CRISPR-Cas的平台展示了其优越的性能,给核酸检测带来了革命性变化,相信通过不断探索与改进,CRISPR-Cas技术将拥有更大的应用潜力。