1例M蛋白干扰电化学发光检测的处理与分析*

汪 玲,李慧明,张 庆,叶斌华,张 青△

南昌大学第一附属医院:1.核医学科;2.检验科,江西南昌 330006

多发性骨髓瘤(MM)是一种以单克隆浆细胞恶性增殖伴单克隆免疫球蛋白大量分泌为特征的恶性浆细胞病,产生的M蛋白沉积可引起患者骨质破坏、肾功能损害、感染、贫血、高黏滞综合征等多种非特异的复杂临床表现。M蛋白具有独特均一的物理特性,且多无免疫功能,但可在特定条件下干扰实验室检测。近年来关于M蛋白干扰常规生化免疫检测的报道屡见不鲜[1-2],涉及比色法及浊度法等多种生化免疫分析方法,亦有M蛋白在化学发光免疫检测中产生干扰的案例[3]。M蛋白根据免疫球蛋白的类型可分为IgG、IgM、IgA、IgE、IgD,以及轻链型、双克隆型和不分泌型。产生检测干扰的免疫球蛋白以IgG和IgM为主,IgA型M蛋白虽在临床发病率较高,但发生检测干扰的现象十分罕见。本文报道了本院近期发现的1例IgA型M蛋白干扰维生素B12(VB12)电化学发光检测的个案及消除干扰的方法。

1 资料与方法

1.1临床资料 患者,男,49岁,双眼视力无痛性下降10 d,加重6 d伴乏力,拟以“糖尿病性视网膜病变(双)”收入本院眼科治疗。既往发现有糖尿病史10余天,口服格列美脲,1片/次,1次/天。查体示神清,精神差,自主体位,中度贫血貌;鼻腔牙龈有出血;全身浅表淋巴结未触及肿大。多层螺旋CT扫描显示双侧多根肋骨骨质破坏并软组织肿块,多个胸椎体及附件、左侧肩胛骨内斑片状低密度影,考虑恶性病变。实验室检查血常规示:白细胞计数(WBC)2.89×109/L,红细胞计数(RBC)1.69×1012/L,血小板计数(PLT) 93×109/L,血红蛋白(Hb)53 g/L,平均红细胞体积(MCV)107.1 fL,平均红细胞血红蛋白含量(MCH)31.4 pg,平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)293 g/L;生化指标:总蛋白(TP)138.9 g/L,清蛋白(ALB)25.0 g/L,球蛋白(GLB) 113.9 g/L,ALB/GLB 0.22,肌酐(CR)111.1 μmol/L,尿酸(UA)475.7 μmol/L;免疫球蛋白+补体:IgG 5.20 g/L,IgA 88.40 g/L,IgM 0.17 g/L;贫血三项检测:铁蛋白619.70 μg/L,叶酸12.05 ng/mL,VB12不能检测,仪器报警“标本有凝块”;血清蛋白电泳:γ球蛋白70.7%;免疫固定电泳:IgA,κ泳道发现异常条带,分型为IgAκ型;游离轻链检测:游离κ轻链>183.00 mg/L;轻链κ 9 740.00 mg/dL;骨髓瘤免疫分型可见31.43%异常克隆性浆细胞;骨髓细胞形态学考虑MM骨髓象。临床主要诊断为MM(IgAκ型)。

1.2方法

1.2.1标本处理 使用分离胶真空采血管采集患者肘部静脉5 mL,室温放置待血液完全凝固后3 000 r/min离心5 min,收集血清,血清铁蛋白、叶酸和VB12检测均采用罗氏Cobas e602全自动免疫分析仪(电化学发光法),检测试剂均采用原装配套试剂。

1.2.2确认干扰VB12检测原因 VB12检测时仪器报警“标本有凝块”结合该患者血液样本试管存在分离胶不翻转上浮的现象,考虑以下原因:(1)样本量太少;(2)真空管分离胶质量问题;(3)离心机的转速不够导致血清未完全析出;(4)患者标本中存在异常的血液成分。为探究干扰原因,统计近3天分离胶不翻转的标本例数,加大样本离心转速至分离胶上浮,分离出血清后再进行检测。

1.2.3消除干扰的方法 稀释法:根据罗氏VB12试剂说明书建议的稀释基质,分别采用罗氏DU稀释液和已知低值血清(VB12<50 pg/mL)对患者血清进行倍比稀释(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32),并比较两种稀释方式所换算的VB12检测值。聚乙二醇 PEG6000 蛋白沉淀法:将250 g/L PEG6000与患者血清等比例混合,涡旋30 s,室温下静置15 min,以 10 000×g离心5 min,取上清液检测VB12,同时选取5份非免疫球蛋白增高的患者标本作为对照,计算此方法的样本回收率。

1.3统计学处理 数据处理采用SPSS22.0统计分析软件,采用配对t检验比较两种基质稀释后的检测结果,以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1近3天分离胶不翻转标本统计 统计核医学科近3天5 028例患者血液标本发现分离胶不上浮标本3例,只占总例数的0.06%。

2.2加大离心机转速至分离胶上浮后的检测结果 将离心机转速由3 000 r/min提高至4 200 r/min(离心时间5 min)时,试管分离胶上浮,析出足量清亮、透明血清,无肉眼可见凝块;将样本再次上机检测,VB12仍不能检测,仪器报警提示“标本有凝块”。

2.3两种基质稀释的VB12检测结果比较 采用罗氏DU稀释液和已知低值血清(VB12<50 pg/mL)两种基质倍比稀释后,所换算的VB12检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两种基质稀释的VB12检测结果比较(pg/mL)

2.4PEG6000蛋白沉淀法结果及回收率 蛋白沉淀法VB12检测换算值(检测值×2)为918.2 pg/mL,5份对照患者标本的回收率分别为94.3%、103.5%、93.5%、92.2%和91.2%,见表2。样本回收率高,提示该方法处理样本所得测定值可靠。

表2 PEG6000蛋白沉淀法VB12检测结果及对照标本回收率

3 讨 论

VB12也称钴铵素,是一种水溶性的有机金属化合物,人体不能合成,其主要来源于肉蛋奶及鱼类制品。人体胃肠道对VB12的吸收取决于胃壁细胞合成的内因子。贫血是MM患者的常见症状,血清VB12缺乏在MM贫血患者中普遍存在[4],故检测MM患者的血清VB12水平十分重要。

患者标本VB12检测时仪器报警提示“标本有凝块”,结合分离胶采血管血液分离异常,分离胶未上浮的现象,笔者统计近3天核医学科患者标本分离胶未上浮比例仅为0.06%,初步排除离心机的转速不够的推测,若为分离胶质量问题,会出现此批次大量分离胶不上浮的情况,排除分离胶质量问题;加大标本离心转速后分离胶上浮,血清析出,但VB12仍未检出,提示患者血液标本可能存在异常血液成分使血清密度增加。

MM产生的大量M蛋白会引起血清蛋白质成分的变化,进而导致血清密度增加[5]。多中心临床研究发现,MM患者大多存在分离胶位置改变的血液分离不良现象,此现象可提示MM的诊断[6]。该患者血液中存在大量IgA型M蛋白,易形成二聚体为主的多种聚合体,以聚合物形式存在的M蛋白可使患者出现黏滞血症,干扰检测吸样[7];罗氏Cobas e602标本针吸取样本为压力感应,吸样时阻力超出阈值即引起仪器报警,此阻力大小与样本的吸样量有关,因此只造成了VB12检测报警。

根据文献报道,采用稀释法和聚乙二醇PEG6000蛋白沉淀法对样本进行处理以消除M蛋白对检测的干扰[8]。为最大限度地降低“基质效应”引起的VB12检测误差,采用罗氏DU稀释液和已知低值血清分别进行稀释检测,结果表明两种基质的检测结果无明显差异,但两种基质的倍比稀释结果呈现非线性,笔者暂无法判断此结果是“基质效应”的影响还是血清中高浓度M蛋白对VB12检测的内源性干扰。蛋白沉淀法对照标本蛋白沉淀法的回收率为91.2%～103.5%,回收率高,该方法处理样本后的测定值可靠;以蛋白沉淀法检测结果为参照,比较倍比稀释结果,笔者发现低稀释倍数时VB12检测结果异常增高,但随着稀释倍数增加其检测值与蛋白沉淀法结果一致,无明显“基质效应”,该患者血清IgA的质量浓度为8.84 g/dL,远高于VB12试剂说明中抗IgA干扰上限1.6 g/dL,推测稀释法检测结果不成线性的主要原因是:低稀释倍数时,高浓度的M蛋白会干扰VB12检测。

VB12检测采用竞争法的原理,使用VB12特异性内因子,样本中的VB12与加入的生物素标记的VB12竞争钌标记的内因子复合物上的结合位点。有案例曾报道,IgGκ型M蛋白对VB12增强化学发光检测法的干扰作用,高水平的M蛋白可与内因子非特异性结合[9],M蛋白可占据内因子上的结合位点,孵育时内因子上能够与生物素标记的VB12结合的空位减少,导致发光信号降低,使得检测结果假性增高。

综上所述,本案例中IgAκ型的M蛋白不仅干扰VB12的检测吸样,同时造成稀释后的VB12检测结果假性增高;低倍数的稀释法难以消除M蛋白干扰,测定结果不可靠,随着稀释倍数增加,M蛋白的干扰作用会减弱。但稀释法的效果取决于稀释倍数和取样准确性,也需要考虑稀释介质的基质效应,不能一概否定此方法。因此,日常检测工作中要重视M蛋白对免疫检测的干扰作用,当检测出现异常或结果与临床征象不相符时,要与临床医生及时沟通,避免发出错误结果。