高通量测序技术在B族链球菌鉴别分型中的研究进展*

易乐晖,王飞玲 综述,吴丽娟,3△ 审校

1.遵义医科大学珠海校区,广东珠海 519000;2.深圳市宝安区妇幼保健院检验科,广东深圳 518106;3.深圳市宝安区妇幼保健院母胎医学研究所,广东深圳 518106

B族链球菌(GBS)是围生期母婴感染首位病原菌,可导致严重的新生儿侵袭性GBS感染[1]。孕产妇阴道和直肠的GBS定植率可达 15%～30%,约50% GBS定植孕产妇在分娩时会经产道传播GBS给新生儿,1%～2%新生儿表现为侵袭性感染[2]。当前,新生儿GBS感染防控主要基于产妇阴道定植GBS菌株的筛查模式[3],对GBS定植母亲分娩时使用抗菌药物,可显著减少新生儿侵袭性GBS感染的发生率[4];但也有研究者质疑普遍筛查的有效性和获益[5],认为99.8%的GBS筛查阳性产妇及其新生儿被不必要地使用了抗菌药物,探索更精准的预防筛查手段是临床检验的重要方向[6-7]。近10年,国内外多个研究团队利用高通量测序技术对GBS菌株进行毒力基因筛选、鉴别分型及分子进化等研究,并取得了积极进展。本文着重探索不同类型的高通量测序技术在GBS鉴别分型中的应用价值,以加深和拓宽对GBS致病机制和分子流行病学的认识,为围生期GBS感染从菌株模式广泛筛查到分子模式精准诊断奠定基础。

1 高通量测序技术概述

基于二代测序(NGS)和三代测序的高通量测序技术,结合不同的应用需求,衍生出多种测序方法,本文涉及的多种测序技术的原理简介及应用场景见表1。

2 高通量测序技术在GBS鉴别分型中的研究进展

2.1基于样本的直接GBS鉴别和分型 16S核糖体RNA(16S rRNA)测序和宏基因组测序(mNGS)技术均在非培养方法检出及鉴定GBS中有潜在的应用价值。妊娠期阴道微生态菌群相关研究发现,mNGS或16S rRNA测序可鉴别GBS,但尚未统计检出率,也未进一步对GBS进行分型[12];有研究发现,16S rRNA测序相较于巢式PCR和定量PCR(qPCR)方法对胎盘中的GBS检出率更高,研究认为与胎盘中GBS的菌量有关,当菌量较少时用16S rRNA检测可能更灵敏,通过对另一组去除污染菌影响的胎盘样本进行2次16S rRNA测序,在5%分娩前孕产妇的胎盘中鉴别出了GBS[13]。已有研究证实,mNGS可在脑脊液中检出包括GBS在内的多种病原菌,对儿童细菌性脑膜炎具有早期诊断价值[14-15]。另外,在培养阴性的感染性心内膜炎患者血液样本和心脏瓣膜样本中,采用mNGS均鉴定出了GBS[16]。

2.2基于菌株的WGS与GBS分型 基于GBS全基因组信息,WGS既可分析传统的分子流行病学信息,如血清型和基因型,也可进一步分析其克隆传播特点并挖掘潜在未知信息。荚膜多糖(CPS)是GBS导致侵袭性疾病的重要毒力因素和疫苗靶标,据其不同可将GBS分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ 10种血清型[17],正处于临床实验阶段的六价CPS结合疫苗可覆盖Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅴ 6种主要荚膜血清型。美国各年龄段来源的6 340株和英国410株新生儿侵袭性菌株的WGS测序结果均显示Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ/Ⅳ和Ⅴ这5～6种血清型占比超过98%[18-19],导致新生儿早发和晚发型疾病的Ⅲ型菌株分别占27.2%和69%,成人Ⅰa型菌株占比20.36%[18]。早期基因分型通常是基于7个管家基因的扩增和测序进行的多种序列分型(MLST)方法,按照等位基因的相似性将各种序列型(ST)进行克隆复合体(CC)归类[18]。core genome MLST(cgMLST)是根据GBS核心基因组序列进行分型,比MLST分辨率更高[20]。全球198项关于GBS的研究中,有1/4的研究包含了MLST,但WGS相关研究不足5%[21],基于WGS可以完成MLST和cgMLST分型[18,22]。有研究已证实,相较于传统检测方法,WGS不仅能更准确对GBS血清型和基因型进行分型,还可以分析荚膜置换和不可分型的原因,并具有发现新的血清型或基因型及其相关突变的优势[22]。根据GBS群体的WGS发现,单核苷酸多态性(SNP)差异不仅可以完成系统进化发育分析,也可用于比较GBS菌株之间的克隆传播特点及关系,有研究认为,SNP差异为0的菌株遗传上相同,SNP差异≤5的菌株遗传上高度相似,可判断为克隆传播[19]。

2.3基于WGS分析GBS菌株的耐药性 GORI等[23]通过WGS首次发现并证实四环素的广泛使用可导致携带四环素耐药基因整合元件(ICE)的CC17菌株在全球流行,新生儿GBS感染率升高,大环内酯类抗菌药物的耐药导致CC1型菌株增加。WGS还检测到青霉素结合蛋白(PBP)2X突变菌株、携带万古霉素耐药基因vanY的CC23菌株和vanG的Ⅱ/ST22、Ⅴ/ST1 GBS菌株,使得GBS对β内酰胺酶类抗菌药物和万古霉素敏感性下降[18,24-25]。我国也有研究基于WGS获取GBS全部耐药信息并检出多种多重耐药簇[26-27]。

2.4WGS鉴别与筛选GBS侵袭性相关毒力基因 目前GBS确切致病的分子机制尚不明确,多数研究表明,GBS的高致病性与多种毒力基因有关,利用WGS检测并鉴别与GBS侵袭致病相关的毒力基因,可进一步分析并预测基因功能。WGS检测全球901株不同宿主的侵袭性GBS菌株,发现其可通过快速获得或缺失基因适应新宿主或生态位环境,几乎所有的菌株有一或多个遗传移动元件(MGE)和致病菌毛岛(PI),如PI-1、PI-2a和PI-2b[28]。WGS在美国最大样本量的侵袭性GBS菌株中几乎都检测到与毒力相关的PI、α蛋白家族基因以及srr1和srr2基因[18]。利用泛基因组关联研究分析1 988株侵袭和定植GBS菌株基因序列的多样性,最终在279个致病特异基因聚集的5种不同功能的CC中检测到与GBS代谢及人类患病相关基因多见于CC17(gcc1732、lepB、inLA_2、gcc1733)和CC23(mntH),其中参与GBS定植、GBS与其他微生物竞争特定生态位和代谢等多种途径的基因存在差异,并发现CC17菌株的16个特异基因的等位变异在侵袭和定植菌株中显著不同[24]。有研究进一步证实了CC17型定植和侵袭GBS菌株有14个基因突变存在SNP差异,确定侵袭菌株致病的关键且特异的基因srr2存在SNP差异,侵袭菌株通过交换染色体片段以适应不同宿主环境,在人类宿主中显示出较强的传播力,并在欧洲、北美、非洲及亚洲地区广泛传播[29]。

2.5RNA-seq鉴别GBS毒力基因 RNA-seq筛选GBS如何在转录组层面调节基因表达适应新的宿主环境和致病,常通过比较分析突变菌株和野生菌株的转录组或不同环境下的菌株转录组来实现。我国在鱼类GBS中发现并鉴定了一种新型XRE家族转录调节因子(XtgS),动物实验发现斑马鱼感染缺失XtgS 因子的菌株较野生型菌株死亡率低,可能其是GBS致病的负性调节因子,RNA-seq发现缺失XtgS的菌株有74和21个基因分别参与上调和下调,这些基因与噬菌体、膜蛋白、转运蛋白、酶、代谢和转运RNA(tRNA)生物合成等过程有关[30]。Cas9是规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)中的核酸内切酶之一,通过降解DNA对GBS毒力基因起调节作用,小鼠模型实验显示Cas9突变菌株较野生型菌株毒力弱,RNA测序发现参与代谢、毒力、细胞壁形成有关的基因以及双组分调节系统(TCS)中的CiaR因子显著失调,证实CiaR因子可促进GBS在阴道定植,对CiaR突变菌株RNA-seq显示有25和33个基因分别参与上调和下调,这些基因包括了Cas9突变体中的上调和下调基因,说明Cas9可以通过其他因子调节GBS基因表达[31]。研究表明,高浓度锌离子不利于野生Ⅲ/ST17型GBS菌株生存,对生存在不同浓度锌离子环境的菌株进行RNA测序发现,包括czcD、nikABCD、mntH2和 mtsABC基因在内的229个基因和adcA基因在内的238个基因分别参与上调和下调,与GBS抵抗宿主来源蛋白的活性有关[32]。值得注意的是,RNA测序往往需要RT-qPCR来验证测序结果的准确性。

2.6Tn-seq鉴别筛选GBS必需基因 Tn-seq可筛选GBS在某种特定生长环境中生存所需的基因,研究WGS中单个基因的适应度,以及基因之间的相互作用关系,还可识别潜在抗体靶标。HOOVEN等[33]首先建立并初步评估了一种基于GBS菌株A909的转座子文库,对其应用Tn-seq筛选出A909生存的必需基因占基因组比例为13.5%,关键基因占比为1.2%。目前该团队还应用该文库和Tn-seq对A909在血液和羊水中生存的必需基因进行筛选,并进一步完成对筛选出的个别必需基因进行基因敲除及RNA测序等功能验证[34-35]。ZHU等[36-37]利用Tn-seq筛选Ⅴ型GBS菌株在全血和血浆中存活的重要基因aroA、metP和mtsA,其中aroA基因是必需基因,W903_1820是该GBS菌株在全血中生长的必需基因;另外,对GBS细胞壁肽聚糖生物合成起催化作用的青霉素结合蛋白(PBP)进行研究,构建野生型菌株和4种pbp(pbp1A、pbp1B、pbp2A、pbp2B)突变菌株文库,经Tn-seq筛查5种菌株中共有350个必需基因,并发现某种pbp突变菌株需要其他pbp作为必需基因。Tn-seq在GBS基因组中的基因饱和度不够高(39%～46%),近期有研究对肺炎链球菌进行CRISPR测序,体现出比Tn-seq更大的优势,可检测所有基因的适应度,但目前尚未将这一技术应用于GBS相关研究[33,38]。

3 小结与展望

对各种类型的人体样本采用非培养方法直接16S rRNA测序或mNGS,数据处理时即可完善GBS鉴别及分型分析,可初步鉴别出临床重要分型的GBS,更有望全面了解GBS的微生态分布特点。基于GBS菌株的WGS已筛选鉴别出较多的与致病性和流行传播相关的毒力基因或分型靶标,可进一步应用于疫苗及诊断方法的设计。应用RNA-seq、Tn-seq筛查GBS可能的毒力调控基因及必需基因等可更全面了解其致病机制。高通量测序技术支撑和推动了GBS鉴别分型的精准分子诊断,我国目前仍较缺乏高通量测序技术在GBS的致病机制或分子流行病学中的应用研究数据,期待未来更快速、简洁的高通量测序技术的发展及标准化、可视化的生物信息学分析的普及,为临床防治GBS感染做出新贡献,也对未来微生物检验的发展提供新思路。