DNAJB11基因在尤文氏肉瘤中的表达及预后价值*

李 鑫,刘震东,李 昂,王红强△

1.河南大学人民医院脊柱脊髓外科,河南郑州 450003;2.河南省人民医院脊柱脊髓外科,河南郑州 450003

尤文氏肉瘤(ES)是一种侵袭性强、低度分化的骨或软组织恶性肿瘤,其在儿童中的发病率仅次于骨肉瘤[1]。近年来随着多学科诊疗模式的应用,部分ES患者预后有所改善,但对于早期转移或复发的患者,其5年生存率仅有20%[2]。目前面临的瓶颈问题是对ES的发病机制尚未阐明,缺乏有效的靶向药物改善患者预后。DnaJ热休克蛋白家族成员B11(DNAJB11)是一种人类蛋白编码基因,在协调内质网和细胞外蛋白质稳态方面发挥多种功能[3-4]。已有研究证实,DNAJB11作为一种致病基因,可促进多种癌症的病理进展[5-6],但是目前较少有DNAJB11对ES影响的报道。因此,本研究将探讨DNAJB11在ES中的表达水平、预后价值、潜在功能及免疫细胞浸润情况,旨在为ES的诊断和治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1数据收集 从UCSC Xena(the University of California Santa)数据库中下载经标准化的泛癌数据集TCGA Pan-Cancer (PANCAN),提取DNAJB11基因在各个样本中的表达数据,并对所有数据进行log2(TPM+1)处理,剔除单个样本个数小于3个的癌症病种,最终获得了26种肿瘤表达数据。本研究从International Cancer Genome Consortium(ICGC)数据库的BOCA-FR项目中下载56例ES患者的RNA测序(RNA-seq)数据和临床相关信息进行生物信息学分析。从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中获取GSE17674数据集,该数据集包含44例ES组织样本和18例正常组织样本。基于该数据集比较ES组织和正常组织之间DNAJB11的表达差异。

1.2荧光定量PCR(RT-qPCR)检测 本研究所使用的人骨髓间充质干细胞(HBMSC)和人尤文氏肉瘤细胞株(TC-32和RD-ES)购自上海舜冉细胞库,所有细胞均在含10%胎牛血清(美国Gibco公司)的DMEM培养基(美国HyClone公司)中培养,培养箱环境设定为37 ℃、5%CO2。使用Total RNA Kit Ⅰ(美国Omega Biotek公司)试剂盒从细胞中提取总RNA,并通过超微量分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)测定RNA浓度,随后使用NovoScript Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(苏州Novoprotein公司)逆转录获得cDNA。采用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus(苏州Novoprotein公司)试剂盒进行PCR反应。内参GAPDH及DNAJB11的引物序列如下:GAPDH正向引物为5′-CAAGGTCATCCATGACAACT TTG-3′,GAPDH反向引物为5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′;DNAJB11正向引物为5′-TTTGGAGGAACCCCTCGTCA-3′,DNAJB11反向引物为5′-AATTGCACTTCCGTTTGCCA-3′。基因表达量采用2-ΔΔCt法分析。

1.3差异表达基因的筛选 本研究使用R软件中的“limma”包筛选差异表达基因(DEGs),根据BOCA-FR数据集中DNAJB11表达水平的中位数,将ES患者分为高表达组和低表达组,以|log2FC|>1和P<0.05为临界值筛选两组间的DEGs。最终,本课题组筛选出1 230个DEGs。

1.4富集分析 富集分析是一种广泛使用的高通量组学数据分析技术,用于探索基因集的生物学功能和作用[7]。基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库是基因富集分析中常用的两种方法,GO分析主要用于目标基因的分类和功能注释分析,包括3个层次,即生物过程、细胞成分和分子功能,KEGG分析则可用来分析目的基因的生物学途径。使用“clusterprofiler”包对DEGs进行GO分析及KEGG分析。以P<0.05为入选标准。

1.5免疫细胞浸润分析 获取BOCA-FR数据集基因表达矩阵,使用“GSVA”包的单样本基因集富集分析(ssGSEA)计算23种免疫细胞的浸润分数,并使用“pheatmap”包绘制热图。使用“vioplot”包比较DNAJB11高表达组和低表达组的免疫细胞浸润差异。

1.6药物分析 Connectivity Map(CMap)数据库是一个药物研发工具,用于探索疾病、基因和药物之间的潜在联系[8]。将DEGs分为上调组和下调组,并上传至CMap数据库,根据富集指数<-0.75和P<0.005的标准,筛选出对ES有潜在治疗价值的药物。

1.7统计学处理 运用R软件(v.4.0.3)进行统计分析和相关图像绘制。采用Kaplan-Meier(K-M)生存曲线方法分析DNAJB11表达对ES患者生存的影响,单因素和多因素COX回归模型分析与生存率相关的预后因素,受试者工作特征(ROC)曲线评估DNAJB11的诊断价值。两组间比较采用Wilcoxon秩和检验,不同DNAJB11表达水平患者临床病理特征比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同DNAJB11表达水平患者临床病理特征比较 根据BOCA-FR数据集中DNAJB11表达水平的中位数,将ES患者分为高表达组(28例)和低表达组(28例),两组临床病理特征比较,差异有统计学意义(P=0.01),提示DNAJB11表达与ES的转移有关。见表1。

2.2DNAJB11在不同肿瘤中的表达水平差异 TCGA PANCAN数据集用于分析DNAJB11在不同肿瘤中的表达差异,最终纳入26种肿瘤。结果显示,DNAJB11在胶质母细胞瘤(GBM)、宫颈鳞癌和腺癌(CESC)、肺腺癌(LUAD)、结肠癌(COAD)、结直肠癌(COADREAD)、乳腺浸润癌(BRCA)、食管癌(ESCA)、胃和食管癌(STES)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、混合肾癌(KIPAN)、胃癌(STAD)、前列腺癌(PRAD)、子宫内膜癌(UCEC)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、肾透明细胞癌(KIRC)、肺鳞癌(LUSC)、肝细胞肝癌(LIHC)、直肠腺癌(READ)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、胆管癌(CHOL)中表达水平显著升高(P<0.05),见图1A。在GSE17674数据集中,ES组织中的DNAJB11表达水平高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1B。

2.3RT-qPCR验证DNAJB11在ES中高表达 为了进一步明确DNAJB11在ES表达水平,本研究采用RT-qPCR检测DNAJB11在人骨髓间充质干细胞(HBMSC)和ES细胞系(TC-32和RD-ES)中的表达水平。结果显示,TC-32、RD-ES和HBMSC细胞中DNAJB11的相对表达水平分别为19.12±1.45、10.15±1.56和1.00±0.11,与HBMSC细胞比较,TC-32(t=24.97,P<0.001)和RD-ES细胞(t=10.15,P=0.009)中DNAJB11表达水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1C。

2.4DNAJB11对ES的预后和诊断价值 采用K-M生存曲线评估DNAJB11对患者生存期的影响,结果显示,DNAJB11高表达可明显缩短ES患者的生存时间(P=0.029),见图2A。通过ROC曲线及曲线下面积(AUC)来评估DNAJB11的价值,结果显示,DNAJB11预测3年生存的AUC为0.709,预测5年生存的AUC为0.634,提示DNAJB11对ES患者的预后具有一定的诊断价值,见图2B。

2.5DNAJB11表达对ES患者预后的影响 单因素分析结果显示,DNAJB11高表达(P=0.020,HR=1.036,95%CI:1.006～1.067)和复发(P<0.001,HR=2.348,95%CI:1.637～3.367)与ES患者的生存率有关(图3A)。多因素分析结果显示,DNAJB11高表达(P=0.002,HR=1.055,95%CI:1.020～1.091)和复发(P<0.001,HR=2.701,95%CI:1.801～4.052)是ES患者预后的独立危险因素(图3B)。

2.6GO分析和KEGG分析 GO分析结果显示,DNAJB11可能参与了内质网应激反应、抗原加工及呈递、内质网膜的组成和主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类蛋白复合物结合等方面(图4A);而KEGG分析显示,DNAJB11与单纯疱疹病毒1型感染、抗原的加工和呈递、内质网中的蛋白质加工和肌萎缩等相关(图4B)。

注:A为K-M曲线;B为ROC曲线。

注:A为单因素分析;B为多因素分析。

注:A为GO富集分析;B为KEGG富集分析。

2.7免疫细胞浸润比较 通过ssGSEA计算免疫浸润评分并绘制热图,使每个样本中23种免疫细胞的浸润情况可视化(图5)。进一步分析DNAJB11高、低表达组的免疫细胞浸润情况,箱线图显示了两组间免疫细胞浸润差异(图6),DNAJB11高表达组的巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、髓源性抑制细胞、调节性T细胞、肥大细胞等22种免疫细胞浸润丰度高于低表达组(P<0.05)。

图5 免疫细胞浸润热图

注:***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05。

2.8CMap分析 CMap用于预测可能逆转DNAJB11基因表达增高的治疗药物,最终筛选出3种对ES有潜在治疗价值药物:粗糠柴毒素、甲氟喹和依米丁,见表2。

表2 CMap分析结果

3 讨 论

作为一种高侵袭性的恶性肿瘤,ES的病死率长期处于较高水平,探索有效的生物标志物对ES的诊断和治疗具有重要意义。由于肿瘤微环境的复杂性,肿瘤的进展往往伴随蛋白质稳态的变化,蛋白质错误折叠已被认为是导致癌症进展的因素之一[9-10]。DNAJB11可编码一种参与内质网中蛋白加工的伴侣蛋白,对蛋白质正确折叠、运输和降解发挥着重要作用[11]。目前,关于DNAJB11对恶性肿瘤病理生理学的调控作用已有多篇报道,例如:DNAJB11可通过抑制Alpha-1-antitrypsin mutant Z的降解来促进肝癌的进展[5];相较于口腔鳞癌癌旁组织,DNAJB11在口腔鳞癌组织中的表达显著升高[6]。在本研究中,通过UCSC Xena数据库纳入的泛癌数据进行分析,最终纳入的26种肿瘤中,DNAJB11在20种肿瘤中呈高表达。阐明DNAJB11在ES中的表达水平及临床意义,将有助于建立一个新的治疗靶点,改进治疗策略。然而,DNAJB11与ES的相关性尚未被揭示。

ICGC数据库纳入了全球多个国家的测序数据,已经成为分子生物研究最常用的数据库之一。通过GEO数据库分析发现,DNAJB11在ES样本中的表达水平明显高于正常样本,为验证这一结果,本研究进一步采用RT-qPCR进行分析,结果显示,相较于正常细胞株,DNAJB11在ES细胞株中的表达显著升高。K-M曲线结果表明,DNAJB11高表达组患者预后明显较差;单因素及多因素COX回归分析显示,DNAJB11高表达可作为ES患者总生存期的独立危险因素;ROC曲线分析显示,DNAJB11对ES具有一定的诊断价值。以上研究结果表明,DNAJB11可能是诊断ES的潜在靶点。

为进一步探究DNAJB11促进ES病理进展的可能机制,本研究对DANJB11高、低表达组的差异表达基因进行GO和KEGG分析。值得提到的是,内质网应激反应是GO分析主要富集结果之一,内质网应激作为癌症的多重调节因子和效应因子,可促进肿瘤细胞的存活,增强化疗的耐药性,目前,内质网应激已被认为是癌症进展和维持恶性细胞的关键驱动因素[12-13]。DNAJB11的高表达可能会通过促进内质网应激及相关信号通路异常激活,进而推动ES的病理进展。因此,靶向内质网应激可能是治疗ES的新方向,但这需要更进一步的研究来证明。另外,KEGG分析结果显示,DNAJB11参与了通过MHC Ⅰ类的抗原加工和呈递及MHC Ⅱ类蛋白复合物的结合。研究表明,MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子可分别将抗原呈递给CD8+T细胞和CD4+T细胞,在适应性免疫系统中发挥关键作用[14-15]。因此,抗原加工和呈递作为癌症的免疫逃避的关键,DNAJB11可能会影响MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子介导的抗原呈递以帮助ES细胞逃避免疫监视。以上富集分析结果表明,DNAJB11可通过多种途径促进ES的发生和发展,进而影响患者预后,这些分子机制可为ES的治疗提供有价值的参考。

肿瘤浸润性免疫细胞是肿瘤微环境中的重要部分,与肿瘤恶性生物学行为和患者预后密切相关[16]。本研究应用ssGSEA分析了DNAJB11表达水平与ES免疫细胞浸润的关系,结果显示,在DNAJB11高表达组发现较高的免疫细胞浸润丰度,其中包括巨噬细胞、髓源性抑制细胞和调节性T细胞等免疫抑制性细胞,提示DNAJB11高表达介导更活跃的肿瘤免疫反应。巨噬细胞可通过PI3Kγ信号通路抑制细胞毒性T细胞的激活,诱导肿瘤免疫抑制[17]。一项研究发现,在人类ES样本中,较高水平的CD68+巨噬细胞(包括M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞)浸润与患者预后不良相关[18]。本研究发现,DNAJB11高表达组的巨噬细胞浸润显著增加,抑制DNAJB11表达可能会减少巨噬细胞浸润,增强T细胞抗肿瘤免疫活性,进而改善ES免疫抑制性微环境。

CMap数据库用于获取可能下调DNAJB11表达水平的药物,根据筛选标准,最终确定3种对ES具有潜在治疗作用的药物:粗糠柴毒素、甲氟喹和依米丁。这些药物已被证实在其他癌症中具有不同程度的抗癌活性:粗糠柴毒素通过抑制细胞生长、触发细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡等机制在多种癌症中表现出显著的抗肿瘤特性[19-21];甲氟喹通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有效靶向胃癌细胞,还可通过破坏溶酶体功能作为胶质母细胞瘤进展的抑制剂[22-23];依米丁可以通过激活与细胞凋亡密切相关的p38通路,抑制细胞外信号调节激酶、c-Jun N-末端激酶和β-连环蛋白这3个信号通路,进而对骨肉瘤细胞发挥抗癌作用[24]。但是,这仅为ES的药物治疗提出一个方向,后续可能需要更多的药物实验来验证。

本研究结果表明,DNAJB11在ES中呈高表达,并且DNAJB11高表达与ES患者预后不良和免疫细胞浸润丰度相关。此外,DNAJB11可能通过内质网应激反应、MHC Ⅰ类的抗原加工和呈递和MHC Ⅱ类蛋白复合物的结合等方面来影响ES的病理进展。本研究结果显示,DNAJB11具有作为ES生物靶点的潜力,并为ES的治疗提供新的研究方向。