气相色谱-质谱联用分析莳萝子中挥发油和油脂的化学成分及其抗氧化活性研究

陈荣玲，陈惠琴，殷超，胡尔西丹·伊麻木，热合巴提·努尔夏提

作者单位：1新疆医科大学药学院，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐 830017；2中国科学院新疆理化技术研究所，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐830011

莳萝子种子含有4%～6%［1-2］挥发油，是常用的民间药，具有温脾肾，开胃，散寒，行气，消肿止痛，除腹胀，止腹痛等功效，主治湿寒性和黏液质性疾病，如关节肿痛，腹胀腹痛，经水不下，小便不利、防治病菌传播等［3-5］。挥发油和油脂具有扩张血管，改善微循环，降低血脂，降低血压，抗动脉硬化，同时还有增强机体免疫功能，抑制肿瘤细胞，促进血液细胞新陈代谢，双向调节中枢神经，增强学习和记忆能力，双向调节血糖、延缓衰老，防治老年斑、黄褐斑等作用［6-9］。本研究旨在莳萝子挥发油、油脂的提取，2021年6月至2022年3月采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）研究分析莳萝子药材中挥发油和脂肪酸的化学成分，建立一种简易、灵敏、准确度高的检测方法［10-15］。通过比较挥发油及脂肪酸的抗氧化活性，筛选其主要生物活性成分［16-19］，有望为莳萝子的质量评价、药理作用的深入研究及进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药材与试剂莳萝子（新疆）、石油醚（60～90 ℃，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）、无水甲醇分析纯、氢氧化钾、无水硫酸钠、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）、抗坏血酸（天津市百世化工有限公司）。

1.2 实验仪器Agilent 7890A－5975C 型气相色谱－质谱联用仪（美国Agilent 公司）；傅立叶变换红外光谱仪（赛默飞公司）；Spectra Max M5-酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；N-1001 型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器厂）；DFY-500 摇摆式高速万能粉碎机（温岭林大机械公司）；JD-2003 型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；101 型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1莳萝子挥发油、油脂提取工艺 挥发油：莳萝子药材烘干粉碎→过筛（60 目）→称取50 g 粉末→加蒸馏水→浸泡24 h→调节温度→调节挥发油提取器提取6～8 h→挥发油。油脂：莳萝子药材烘干后粉碎→过筛（60 目）→称取50 g 粉末→用滤纸筒包裹置于索氏提取器中→调节温度→加入90%石油醚75 mL→脱脂4 h→旋转蒸发仪去溶剂→油脂。挥发油∕油脂提取率（%）=（实际提取的量∕药材的量）×100%。

1.3.2GC-MS 分析 样品甲酯化：1.0 mL 提取物于容量瓶（10 mL）→加入2 mL 石油醚-甲醇溶液→加入2 mL 氢氧化钾-甲醇溶液→振摇→加蒸馏水定容至刻度→静止分层→吸取上清液至试管中→加入无水硫酸钠干燥→静止分层→过滤→吸取上清液。分析条件：HP-INNOWAX 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；起始温度为100 ℃，保持2 min，以10 ℃∕min升温至200 ℃，再以5 ℃∕min升温至260 ℃，保持10 min；载气为氦气；流速为1.0 mL∕min；进样口温度为260 ℃；进样量0.2 μL；分流比50∶1；电离方式为EI；电离能量为70 eV；离子源发生器温度为230 ℃；质量扫描范围为30～350 m∕z，全离子扫描。

1.4 抗氧化实验

1.4.1DPPH 清除能力测定 1 mL 0.2 mmol∕L DPPH-乙醇溶液1 mL 不同浓度的样品溶液混合，在黑暗处反应30 min，并在517 nm 处测定吸光度。以维生素C（VC）为阳性对照，按以下公式计算清除率：DPPH 自由基清除率（%）=［A0-（Ai-Aj）］∕A0×100%（Ai为样品组吸光度；Aj为对照组吸光度；A0为空白组吸光度）。

1.4.2ABTS 自由基清除能力测定 将7 mmol∕L ABTS 乙醇溶液与2.45 mmol∕L 过硫酸钾溶液等体积混合得到ABTS自由基试剂。并用乙醇稀释，调整其在734 nm 处测定吸光度为0.7 左右。取1 mL ABTS自由基试剂与3 mL不同浓度的样品溶液混合，黑暗处反应10 min，并在517 nm处测定吸光度。以VC为阳性对照，按以下公式计算清除率：ABTS 自由基清除率（%）=［A0-（Ai-Aj）］∕A0×100%（Ai为样品组吸光度；Aj为对照组吸光度；A0为空白组吸光度）。

2 结果

2.1 莳萝子挥发油、油脂提取率挥发油提取中选取最佳条件，料液比1∶4，温度94.5 ℃，提取时间8 h，经3次平行测定，得提取率为（5.850±0.141）%。称取20 g药材粉末，用索氏提取器加入90%石油醚75 mL脱脂4 h，经3 次平行测定，得油脂提取率（13.168±0.117）%。数据满足评价指标要求，结果可靠、准确。

2.2 莳萝子挥发油、油脂组成成分分析

2.2.1莳萝子挥发油化学成分分析 取莳萝子挥发油1 μL，用GC-MS 联用仪进行测定，其结果经质谱数据库（NIST11.L）检索，选择匹配度高于85 的峰，与标准谱图进行比对分析，得出了莳萝子挥发油的各化学成分，按峰面积归一化计算各峰面积的质量分数，结果见表1。从莳萝子挥发油中鉴定出19 种化学成分。主要包括单萜类9 种（29.471%），黄酮类4 种（61.418%），醇类3 种（0.165%），芳香烃类及其他3种（0.39%）。

表1 莳萝子挥发油的组成（匹配度≥85）及相对百分含量

2.2.2莳萝子脂肪酸化学成分分析 取莳萝子脂肪酸1 μL，用GC-MS 联用仪进行测定，其结果经质谱数据库（NIST11.L）检索，选择匹配度高于85 的峰，与标准谱图进行比对分析，得出了莳萝子挥发油的各化学成分，按峰面积归一化计算各峰面积的质量分数，结果见表2。从莳萝子提取的甲酯化溶液中鉴定出16 种化学成分，其中脂肪酸9 主种，包括十六烷酸甲酯（1.78%）、棕榈酸乙酯（0.66%）、亚油酸甲酯（5.58%）、顺式亚油酸（5.58%）、十八碳六烯酸甲酯（56.73%）、硬脂酸甲酯（0.72%）、亚麻酸乙酯（2.06%）、缩水甘油棕榈酸酯（1.56%）、（Z）-9-十八烯酸（0.56%）。

表2 莳萝子油脂的组成（匹配度≥85）及相对百分含量

2.3 抗氧化活性

2.3.1DPPH 自由基清除能力 DPPH 自由基清除能力是以VC 为阳性对照，进样量分别为20、40、60、80、100 mg∕L，经3次平行测定，并代入DPPH 自由基清除率公式，结果见表3，在允许的误差范围之内。

表3 莳萝子挥发油、油脂DPPH自由基清除能力测试结果及误差分析∕%

通过函数绘图软件绘制DPPH 自由基清除率与浓度之间的关系图，如图1所示，莳萝子挥发油和油脂的清除DPPH 能力与浓度呈正相关。在低浓度时莳萝子油脂清除自由基能力比挥发油的高，当浓度在70 mg∕L 以上时挥发油的清除自由基能力更高。莳萝子挥发油的IC50值（半抑制浓度）为42.963 mg∕L，莳萝子油脂的IC50值（半抑制浓度）为28.430 mg∕L，阳性对照VC 的IC50 值（13.946 mg∕L）。表明，莳萝子油脂有较高的DPPH自由基清除能力。

图1 莳萝子挥发油、油脂1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力

2.3.2ABTS自由基清除能力 ABTS自由基清除能力是以VC为阳性对照，进样量分别为20、40、60、80、100 mg∕L，经3次平行测定，并代入ABTS自由基清除率公式，结果见表4所示，在允许的误差范围之内。

表4 莳萝子挥发油、油脂ABTS自由基清除能力测试结果及误差分析∕%

通过函数绘图软件绘制ABTS 自由基清除率与浓度之间的关系图，如图2所示，莳萝子挥发油和油脂的清除ABTS 能力与浓度呈正相关。在低浓度时莳萝子油脂清除自由基能力比挥发油的高，当浓度在50 mg∕L 以上时挥发油的清除自由基能力更高。莳萝子挥发油的IC50值（半抑制浓度）为21.129 mg∕L，莳萝子油脂的IC50 值（半抑制浓度）为9.722 mg∕L，阳性对照VC 的IC50值（6.029 mg∕L）。表明，莳萝子油脂有较高的ABTS自由基清除能力。

图2 莳萝子挥发油、油脂2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）自由基清除能力

3 结论

实验结果表明，莳萝子挥发油主要含有黄酮类化合物（61.418%）及萜类化合物（29.471%），是抗氧化、抗肿瘤以及动脉硬化的主要活性成分。莳萝子油脂脂肪酸含量丰富，主要由油酸甲酯（5.58%）、顺式亚油酸（5.58%）、十八碳六烯酸甲酯（56.73%）组成。抗氧化实验结果证实，提取物具有较高的清除自由基（DPPH、ABTS）能力，且与浓度呈正相关，具有较高的药用活性。其在医药、化妆品和食品工业中开发为天然抗氧化剂和抗动脉硬化等保健品前景较广。