坤泰胶囊对围绝经期大鼠血管内皮损伤及卵巢组织中血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子-1表达的影响

李艳莹，范立磊，吴玲玲，张洁莉，王秀娟，李慧芸

作者单位：1邢台医学高等专科学校第二附属医院妇科，河北 邢台 054000；2邢台市平乡县人民医院内科，河北 邢台 054500；3邢台医学高等专科学校教研处，河北 邢台054000

衰老是正常的生理过程，卵巢是对衰老最敏感的器官。卵巢老化的主要特征是卵泡数量和卵母细胞质量下降［1］。围绝经期是女性衰老的最主要标志，绝经后，随着卵巢功能的下降，卵巢的抗氧化能力可能会降低［2］。围绝经期妇女过多的卵巢活性氧（ROS）产生会破坏细胞的脂质、脂肪酸和蛋白质组成，从而破坏细胞的正常结构和功能［3］。中医认为肾虚是其卵巢老化的基础病因，冲任气血失调是其发病的主要机制，包含虚、实两个方面，虚者由于冲任亏败，源断其流；实者因邪气阻隔冲任，经血不通。而西医则认为卵巢老化、功能衰退与自身免疫、遗传、先天酶缺乏、医源性等因素有关，尤其是长期忧郁、焦虑等不良情绪、不规律的饮食起居等生活习惯对卵巢功能有较大的损伤。坤泰胶囊是一种经典的中药方剂，最早见于《伤寒杂病论》［4］。坤泰胶囊的处方由熟地黄、黄连、白芍、黄芩、阿胶及茯苓等6 种中草药组成，主要用于改善女性围绝经期相关症状［5］。先前的研究表明，坤泰胶囊与亮丙瑞林联合治疗子宫内膜异位时，坤泰胶囊能明显降低阴道出血率和乳房胀痛的发生率［6］。有研究发现，坤泰胶囊能通过其抗氧化和抗凋亡作用，对毒性药物诱导的大鼠子宫和卵巢毒性起到预防作用［7］。但有关坤泰胶囊对围绝经期大鼠血管内皮及卵巢组织保护作用的研究较少，坤泰胶囊对延缓卵巢衰老的作用机制也尚未阐明。本研究于2017年5月至2018 年1 月以围绝经期雌性大鼠和原代培养的卵巢颗粒细胞为研究对象，探讨坤泰胶囊是否具有保护卵巢功能的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物40只SPF雌性SD 大鼠，12月龄，体质量（348.00±40.05）g，购于河北医科大学实验动物公共服务平台，许可证号：SCXK（冀）2020-001。坤泰胶囊（0.5 克∕粒）购于贵阳新天药业股份有限公司，批号Z20000083，实验中用蒸馏水配置成混悬液进行大鼠灌胃。实验方案符合中华人民共和国科技部《实验动物管理国家标准及规范》。所有大鼠均饲养在（25±3）℃恒温环境内，12 h 为一个光暗周期，可以自由获取食物和水。由于体质量对围绝经期大鼠激素分泌水平有明显影响，因此采用随机区组设计对大鼠进行分组。首先对40 只大鼠进行称重，将大鼠根据体质量从大到小分为10 个区，即每个区4 只大鼠。在每个区中，再利用随机数字表法随机抽取大鼠分别进入对照组（n=10）、坤泰胶囊低剂量组（L-KT 组，n=10）、坤泰胶囊中剂量组（M-KT组，n=10）、坤泰胶囊高剂量组（H-KT 组，n=10）。对照组：给予大鼠灌胃对照溶液；L-KT 组：给予坤泰胶囊灌胃1.0 g∕kg；M-KT 组：给予坤泰胶囊灌胃2.0 g∕kg；H-KT 组：给予坤泰胶囊灌胃4.0 g∕kg，每天一次，连续12 w。为了评估大鼠发情周期的不同阶段，在治疗前和治疗后的15 d 里，每天检查阴道涂片。阴道涂片用0.04%锥虫蓝染色，用明视场显微镜观察细胞学特征。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 卵巢颗粒细胞原代培养成年雌性SD 大鼠（21日龄）皮下注射孕马血清促性腺激素50 IU，48 h后处死。取卵巢立即用磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗，置于DMEM∕F12 培养液中。在解剖显微镜下对卵泡进行针刺，收获颗粒细胞，然后用200 μm 不锈钢网过滤纯化。1 000g离心5 min 后，将细胞悬浮于培养基中，用血细胞计数仪计数。将细胞接种于96 孔板（1×105个∕孔）或6 孔板（1×107个∕孔），在含有15%胎牛血清、睾酮、100 U∕mL 青霉素和100 g∕L 链霉素的DMEM∕F12 培养基中37 ℃和5%二氧化碳培养48 h，使细胞贴壁。将细胞按随机数字表法分为五组：对照组、H2O2干预组、H2O2联合3 种浓度的坤泰胶囊（5 μM、20 μM 和50 μM）干预，培养6 h后，用放射免疫法测定培养液中雌二醇的生成量。提取细胞总蛋白，用蛋白质印迹法检测蛋白表达。

1.3 细胞活力测定采用CCK-8 比色法测定细胞存活率。培养结束时，向96 孔板中细胞中加入200 μl DMEM∕F12+20 μL CCK-8 试剂，37 ℃、5%二氧化碳培养箱中孵育3 h。使用微型平板阅读器在450 nm 波长下测量每个孔的光密度（OD）值。根据公式，细胞相对活力=实验组OD 值∕对照组平均OD 值进行计算。每组设5 个复孔，每次测量至少重复3次。采用放射免疫法测定雌二醇、卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）水平。

1.4 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测采用RT-PCR 检测卵巢组织中血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的mRNA 表达。用TRIzol 试剂提取卵巢总RNA。根据供应商的说明，使用PrimeScript first Strand cDNA 合成试剂盒从2 μg 总RNA 合成互补DNA（cDNA）。使用SYBR PreMix Ex TaqμⅡ试剂盒和10 μL 的SYBR PreMix Ex Taq™Ⅱ试剂盒，进行实时定量™扩增，将基因的表达水平归一化为β-肌动蛋白mRNA 的表达水平。使用应用生物系统7500 型进行实时聚合酶链反应。反应条件为：95 °C 5 min，95 °C 30 s，63°C 50 s，72 °C 60 s，30 个循环，72 °C 5min。基因引物序列见表2。目的基因的相对表达量由2-ΔΔCt计算表示。见表1。

表1 基因引物序列

1.5 蛋白质印迹法检测蛋白表达提取细胞总蛋白，利用BCA 蛋白分析试剂盒进行蛋白质定量。用10% SDS-PAGE 分离总蛋白（20 μg），并将其转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将5%脱脂奶粉溶于含0.1%吐温20 的Tris-Buffer 溶液中进行封闭，然后与VEGF 多克隆抗体（1∶1 000 稀释，美国Abcam 公司）、IGF-1多克隆抗体（1∶1 000稀释，美国Abcam公司）、GAPDH 单克隆抗体（1∶1 000 稀释，美国Abcam公司）在4 ℃下孵育过夜。第2 天，PBS 洗膜3 次，与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗兔IgG 抗体在室温下孵育1 h。在暗室加入适量的ECL 光液显影固定，扫描条带后用ImageJ 软件进行灰度值分析，计算蛋白质的相对表达量。

1.6 HE 染色及免疫组化HE 染色：分离卵巢组织，在4%多聚甲醛缓冲液中固定48 h，石蜡包埋切片。用旋转式切片机将组织切割成厚度为5 μm 的连续切片。切片用二甲苯脱蜡，用梯度浓度乙醇脱水，然后用苏木素和伊红染色，在光学显微镜下观察。免疫组织化学：取大鼠卵巢石蜡切片，二甲苯脱蜡，分级浓度乙醇脱水。在95 ℃的柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中孵育20 min，然后在室温下冷却1 h。切片用0.3%H2O2在暗室中处理10 min，以抑制内源性过氧化物酶活性。阻断非特异性反应30 min 后，与VEGF、IGF-1 兔多克隆抗体在4 ℃孵育12 h。然后，与二抗在37 ℃孵育1 h，再用DAB和苏木素进行复染。

1.7 统计学方法采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 5.0 软件进行数据处理。计量资料采用表示，多组间比较采用随机区组设计的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 坤泰胶囊对大鼠一般情况及动情周期的影响用坤泰胶囊治疗围绝经期大鼠15 d，每日阴道细胞学检查测定其动情周期。雌性大鼠的正常发情周期为4～5 d，可分为动情前期、动情前期、动情后期和动情间期四个时期。所有15 月龄大鼠的动情周期均终止于动情期（50%）或动情间期（50%），表明所有大鼠的动情周期均已终止。与对照组相比，3 种剂量的坤泰胶囊对围绝经期大鼠的发情周期均无明显影响。见表2。

表2 坤泰胶囊对大鼠发情周期的影响∕只

2.2 坤泰胶囊对大鼠主动脉血管壁结构的影响HE染色显示，对照组大鼠主动脉内皮可见凸起或缺损改变，动脉中膜明显增厚，内膜结构紊乱，层次分界欠佳。L-KT 组、M-KT 组、H-KT 组大鼠主动脉内皮细胞均有不同程度改善，未见明显凸起或缺损改变，内膜相对光滑，血管壁各层次分界清晰。见图1。

图1 坤泰胶囊对大鼠主动脉血管壁结构的影响（HE染色×40）

2.3 坤泰胶囊对大鼠宫腔壁结构的影响HE 染色显示，对照组、L-KT 组大鼠宫腔壁明显较薄，柱状上皮失去部分正常结构，细胞排列紊乱，腺体数量减少。M-KT组、H-KT组大鼠宫腔壁结构明显改善，柱状上皮结构相对完整，细胞排列整齐，黏膜层出现腺体。见图2。

图2 坤泰胶囊对大鼠子宫宫腔壁结构的影响（HE染色×200）

2.4 坤泰胶囊对大鼠卵巢形态学改变的影响7为验证坤泰胶囊对围绝经期大鼠卵巢形态学改变的影响，对卵巢石蜡切片进行HE 染色，结果显示，对照组大鼠卵巢呈现明显的衰老特征，表现为卵泡储备耗竭，卵巢间质致密，卵巢基质比例明显增加。与对照组相比，L-KT 组、M-KT 组、H-KT 组大鼠的原始卵泡数量、窦状卵泡数目都有一定程度的恢复，结构趋于改善。见表3。

表3 四组大鼠各级卵泡数量比较∕（个，）

表3 四组大鼠各级卵泡数量比较∕（个，）

注：①与对照组比较，P＜0.05。②与L-KT组比较，P＜0.05。③与M-KT组比较，P＜0.05。

2.5 坤泰胶囊对围绝经期大鼠血清激素水平的影响与对照组相比，L-KT 组、M-KT 组、H-KT 组大鼠外周血雌二醇水平逐渐升高（P＜0.05），FSH、LH 水平显著下降（P＜0.05）。两两比较后发现，H-KT组大鼠雌二醇水平显著高于L-KT 组、M-KT 组，而H-KT组大鼠FSH、LH 水平显著低于L-KT 组、M-KT 组，均差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 坤泰胶囊对围绝经期大鼠血清激素水平的影响∕

表4 坤泰胶囊对围绝经期大鼠血清激素水平的影响∕

注：FSH为卵泡刺激素，LH为黄体生成素。①与对照组比较，P＜0.05。②与L-KT 组比较，P＜0.05。③与MKT组比较，P＜0.05。

2.6 坤泰胶囊对围绝经期大鼠卵巢VEGF、IGF-1表达的影响RT-PCR 检测结构显示，对照组、L-KT组、M-KT 组、H-KT 组VEGF mRNA 相对表达量分别为1±0.1、1.6±0.2、2.3±0.4、3.1±0.4，IGF-1 mRNA 相对表达量分别为1±0.1、1.4±0.1、2.1±0.3、2.8±0.5，HKT组VEGF mRNA、IGF-1 mRNA相对表达量均显著高于其他组。蛋白质印迹法检测结果与RT-PCR 结果趋势一致。这表明，坤泰胶囊可以提高围绝经期大鼠卵巢中VEGF、IGF-1 的mRNA 及蛋白的表达。见图3。

图3 坤泰胶囊对围绝经期大鼠卵巢VEGF、IGF-1表达的影响

2.7 免疫组化检测VEGF、IGF-1 蛋白表达采用免疫组化进一步检测VEGF、IGF-1 蛋白的表达和定位，结果发现，VEGF、IGF-1 在卵巢中的表达主要定位于生长卵泡颗粒细胞和黄体细胞。与对照组相比，L-KT 组、M-KT 组、H-KT 组大鼠卵巢组织中VEGF、IGF-1蛋白的阳性表达率显著更高。见图4。

图4 免疫组化检测大鼠卵巢组织血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）蛋白表达（免疫组化法×200）

2.8 坤泰胶囊对大鼠卵巢颗粒细胞活力和雌二醇产生的影响CCK-8法检测坤泰胶囊对体外培养的颗粒细胞活力的影响。与对照组相比，H2O2（400 μM）组细胞存活率下降约40%（P＜0.01）。然而，当H2O2与不同浓度的坤泰胶囊（5 μM、20 μM、50 μM）共同作用时，我们发现20 μM 和50 μM 的坤泰胶囊可以挽救H2O2诱导的细胞损伤（P＜0.001），提示坤泰胶囊对体外培养的颗粒细胞具有保护作用。此外，采用放射免疫法检测了坤泰胶囊对培养的颗粒细胞产生雌激素的影响。结果表明，经H2O2处理后，雌激素分泌量较对照组减少约39%（P＜0.001）。见表5。

表5 坤泰胶囊对大鼠卵巢颗粒细胞活力和雌二醇产生的影响∕

表5 坤泰胶囊对大鼠卵巢颗粒细胞活力和雌二醇产生的影响∕

注：①与对照组比较，P＜0.05。②与H2O2干预组比较，P＜0.05。

3 讨论

在本研究中，我们利用12 月龄的SD 大鼠模拟围绝经期女性的生理状态。首先，通过测定围绝经期雌性大鼠的动情周期，结果发现，12 月龄大鼠都已进入围绝经期，发情周期不规则或延长。给予坤泰胶囊干预后，与对照组相比，坤泰胶囊干预组大鼠动情周期无明显变化。这表明，坤泰胶囊对维持或逆转围绝经期大鼠的动情周期没有明显作用。围绝经期时，雌激素水平下降，而LH 和FSH 水平升高。有研究发现，中药制剂人参皂苷Rg3 可抑制胎盘和卵巢微粒体中雄烯二酮芳转化为雌酮，抑制睾酮芳转化为雌二醇。也可发挥大鼠卵巢细胞对氯化镉诱导的生殖激素失衡的保护作用［8］。FSH 和LH 与卵巢组织的生长和生殖活性的控制密切相关［9］，在绝经期、卵巢切除术后及早熟性卵巢衰竭患者中，可检测到FSH 明显上升，FSH 与LH 之间及FSH与雌激素之间的异常关系与多囊卵巢病等密切相关［10］。LH浓度升高多见于性腺功能减退，男性多见于原发性睾丸衰竭和精细管发育不全等［11］。坤泰胶囊的处方由熟地黄、黄连、白芍、黄芩、阿胶及茯苓等6种中草药组成［12］，刘颖等［13］研究发现，高剂量阿胶干预后小鼠子宫系数明显增大，血清雌二醇水平升高，血清FSH、LH 水平降低，这表明，阿胶对正常雌性小鼠具有一定的雌激素样作用。魏丹、张旭东［14］报道称，含茯苓成分的胶囊可显著改善卵巢早衰大鼠性激素水平，减少卵巢细胞凋亡，这可能与抑制Fas∕FasL信号通路有关。对大鼠外周血激素进行检测后发现，与对照组相比，L-KT 组、M-KT 组、H-KT 组大鼠外周血雌二醇水平逐渐升高，FSH、LH水平显著下降。尤其H-KT 组效果最为显著，这表明，高剂量坤泰胶囊对大鼠外周血激素失衡的调节作用最为明显。

雌激素在体内具有血管保护效应［15］。动物试验和临床流行病学资料显示，雌激素具有降低血脂，抑制血小板黏附聚集，抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移和细胞外基质合成的作用，从而发挥抗动脉硬化效应［16］。绝经后由于雌激素减少，血液中胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、三酰甘油水平上升。本研究通过HE 染色发现，对照组大鼠主动脉内皮可见凸起或缺损改变，动脉中膜明显增厚，内膜结构紊乱，层次分界欠佳经坤泰胶囊干预后，各组大鼠主动脉内皮细胞均有不同程度改善，内膜相对光滑，血管壁各层次分界清晰。这表明，坤泰胶囊在改善大鼠激素水平及卵巢功能的同时，对大鼠血管功能也有一定的保护作用。

IGF-1 能调节心脏的生理和病理状况，具有舒张血管，降低血管阻力，增加器官血流量的作用［17］。VEGF 是主要的血管生成调节因子，参与内皮细胞生理的多个方面。生物信息学分析表明，VEGF 与核编码的线粒体基因在小鼠多种生理条件下紧密共表达，在新陈代谢中起着关键作用［18-19］。本研究发现，坤泰胶囊可以提高围绝经期大鼠卵巢中VEGF、IGF-1 的mRNA 及蛋白的表达。这表明，坤泰胶囊可能通过促进血管生成、调节生殖激素改善卵巢储备功能。为了进一步证实体内实验结果，我们将原代卵巢颗粒细胞在H2O2和3种浓度坤泰胶囊培养液中进行培养，结果发现，坤泰胶囊可以修复H2O2诱导的细胞损伤，提示坤泰胶囊对体外培养的卵巢颗粒细胞的具有保护作用。

综上所述，本研究发现，坤泰胶囊对围绝经期大鼠的血管功能有一定保护作用，且能通过促进卵巢细胞中VEGF、IGF-1的表达促进卵巢功能。

（本文图1，2，4见插图6-3）