基于网络药理学及分子对接技术探讨大黄治疗急性胰腺炎的可能分子机制

吴波，袁丽萍，朱德发

作者单位：1中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）急诊医学科，安徽 合肥 230001；2安徽医科大学第一附属医院，a儿科，b老年内分泌科，安徽 合肥230022

急性胰腺炎的西医治疗手段包括药物和手术治疗，其中药物治疗以抑制胰酶、维持循环和内环境、预防感染等为主。结合传统中医药可以提高对该病治疗的有效率、改善病人的临床症状、降低并发症的发生［1-2］。其中治疗该病常用的中药主要有大黄、芒硝等，但是其作用机制尚未明确。

因为网络药理学可广泛应用于中药活性化合物发掘、整体作用机制阐释等方面［3］；分子对接技术可将化合物配体与蛋白受体模拟结合，预测其作用模式及结合能，进而实现药物的筛选与设计［4-5］。所以，本研究采用网络药理学方法和分子模拟对接技术，探讨中药大黄在急性胰腺炎治疗中产生作用的有效成分和可能的分子作用机制。

1 资料与方法

1.1 检索大黄活性成分和药物靶标2021 年10 月至2022 年2 月，以“大黄”为检索词，在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：∕∕old.tcmsp-e.com∕）检索，以OB≥30%、DL≥0.18 为切点筛选有效成分［3，6］。随后在该平台汲取有效成分相映射的基因靶标，通过比对Universal Protein 平台数 据（https：∕∕www.uniprot.org∕），得到靶标基因简称。

1.2 检索疾病靶标从Genecards（https：∕∕www.genecards.org∕）、DisGeNET（https：∕∕www.disgenet.org∕）、OMIM（https：∕∕www.omim.org∕）、pharmGKB（https：∕∕www.pharmgkb.org∕）数据库中以“Acute pancreatitis”为检索词检索。

1.3 获取大黄-急性胰腺炎交集靶标通过上述步骤得到药物靶标与疾病靶标取交集，绘制可视化的韦恩（Venn）图。

1.4 PPI 网络的构建和关键靶标的获取于String（https：∕∕string-db.org∕）平台中，导入交集靶标，物种选择人类，得到蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）。然后通过Cytoscape（3.8.2 版）插件CytoNCA 进行拓扑分析，计算网络中各节点的度中心性（DC）、接近中心性（CC）、介数中心性（BC）、特征向量中心性（EC）、局部连通性（LAC）、网络中心性（NC），找出关键靶标［7］。

1.5 药物成分-疾病靶标网络的构建Cytoscape 程序中输入前面得到的药物成分及交集靶标，构建“大黄活性成分-疾病靶标”网络，并剔除孤项，后选择插件CytoNCA 计算节点度值，找出关键有效成分。

1.6 基因富集分析及可视化交集基因本位（GO）功能富集分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，通过R 软件“Annotation-Hub”“ggplot2”数据包运行并可视化。

1.7 分子对接及可视化从PubChem 平台（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）检索下载大黄成分的2D结构文件。运用ChemOffice2014 处理后导出3D 结构。从PDB数据平台（http：∕∕www.rcsb.org）获取关键蛋白HSP90AA1（PDB ID 5J27）、caspase-3（PDB ID 1CP3）、CASP8（PDB ID 1F9E）、PTGS2（PDB ID 5F19）的3D 结构文件，利用Pymol 软件对3D 结构去水分子等处理。再用Autodock Tools 4.0 软件中“add hydrogen”命令对3D 结构进行加氢处理。以Autodock Vina将处理后的药物3D结构与蛋白3D结构进行分子模拟对接，计算结合能。取结合能最低构象结果，导入Pymol进行可视化。

2 结果

2.1 大黄活性成分及作用靶标共筛选活性成分16种（表1）。数据库预测、删除重复项后，共得到62个大黄潜在作用靶标。包括：雄激素受体（AR），B细胞淋巴瘤基因2（BCL2），BCL2相关X蛋白（BAX），乙酰胆碱M3 受 体（CHRM3），乙酰胆碱M1 受 体（，CHRM1），乙酰胆碱M4 受体（CHRM4），尼古丁性乙酰胆碱受体α7 亚型（CHRNA7），半胱氨酸蛋白酶9（CASP9），胱天蛋白酶-3（caspase-3），CASP8，凝血因子X（F10），凝血酶原（F2），PTGS2，凝血因子Ⅶ（F7），雌激素受体2（ESR2），二肽酰胺酶4（DPP4），HSP90AA1，胰蛋白酶原1（PRSS1），核受体共激活因子2（NCOA2），DNA 拓扑异构酶Ⅱα（TOP2A），钙∕钙调素依赖激酶MT（CAMKMT），钠离子通道α亚单位5（SCN5A），血管内皮生长因子受体2（KDR），过氧化物酶体素H2 合酶1（PTGS1），醛糖还原酶1（AKR1B1），JUN，雌激素受体1（ESR1），检查点激酶1（CHEK1），蛋白激酶Aα催化亚单位（PRKACA）微管相关蛋白2（MAP2），蛋白激酶抑制剂α（PKIA），免疫球蛋白G1（IGHG1），CDKN1A，真核翻译起始因子6（EIF6），肿瘤坏死因子α 诱导蛋白6（TNFAIP6），TP53，脂肪酸合酶（FASN），蛋白激酶Cε（PRKCE），细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1），蛋白质紫外线过度表达诱导因子（PCNA），MYC，白细胞介素（IL）-1β，蛋白激酶Cδ（PRKCD），细胞周期蛋白B1（CCNB1），二肽酶1（DPEP1），过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG），一氧化氮合酶2（NOS2），克鲁伯因样因子7（KLF7）。

表1 大黄活性成分表

2.2 急性胰腺炎疾病相关靶标筛选了急性胰腺炎的相关基因靶标，其中Genecards、DisGeNET、OMIM、DragBank、PharmGkb 数据库分别得到6 989、435、69、6、121 个靶标，合并去重后共得到7 111 个作用靶标。

2.3 大黄-急性胰腺炎交集靶标综合分析药物和疾病靶标，发现大黄与急性胰腺炎相关交集靶标共55 个，包 括NOS2，AR，F10，PTGS2，F7，TOP2A，ESR2，DPP4，HSP90AA1，PRSS1，NCOA2，F2，SCN5A，KDR，PPARD，PTGS1，AKR1B1，JUN，ESR1，CHEK1，PRKACA，PGR，KCNH2，DRD1，CHRM3，CHRM1，ADRA1A，CHRM2，ADRB2，CHRNA2，SLC6A4，OPRM1，CHRNA7，BCL2，BAX，CASP9，caspase-3，CASP8，PRKCA，PON1，MAP2，CDKN1A，EIF6，TNFAIP6，TP53，FASN，PRKCE，CDK1，PCNA，MYC，IL-1β，PRKCD，CCNB1，DPEP1，PPARG3。见图1。

图1 大黄与急性胰腺炎靶标交集韦恩图

2.4 PPI 构建STRING 库中导入55 个交集靶标生成的PPI 包含55 个节点288 条边，见图2A。通过计算得到各节点的相关参数，其中BC中位数为13.50，CC 中位数为0.46，DC 中位数为16，EC 中位数为0.08，LAC 中位数为8.5，NC 中位数为9.21。筛选出参数均大于中位数的节点并定义为核心基因靶点，随后进行拓扑分析，共提取到节点18 个（见图2B 黄色部分）。然后以上述方法再次拓扑分析，提取核心节点8 个，分别为CASP8、HSP90AA1、caspase-3、TP53、MYC、CDKN1A、JUN、PTGS2.以此作为下一步分析的核心靶标（图2C）。

图2 大黄与疾病交集靶标蛋白作用拓扑网络：A为交集靶标拓扑网络；B为初筛核心靶标拓扑网络；C为最终核心靶标拓扑网络

2.5 “大黄有效成分-交集靶标”网络度值分值高的潜在有效活性成分为β-谷甾醇（MOL000358）、芦荟大黄素（MOL000471）、泽兰黄醇（MOL002235），见图3。

图3 “大黄有效成分-交集靶标”网络

2.6 富集分析GO 分析结果包括3 项：生物过程（BP）结果1 626 条、细胞组分（CC）结果64 条、分子功能（MF）结果160 条，以P.adjust＜0.01 筛选差异结果，每项可视化差异显著的前10 位结果。KEGG 结果119 条，以P.adjust＜0.01 筛选差异结果，并可视化前30条结果。可视化均以条形图表示。

GO 分析提示，其参与的生物过程包括：细胞对药物的反应、节律过程、对氧水平的反应等；细胞组分包括膜筏、膜微区、膜区等；分子功能包括：核受体活化、转录因子活化，直接配体调控序列特异性脱氧核糖核酸（DNA）结合、乙酰胆碱受体活化等，见图4。KEGG 富集通路包括p53 信号通路、乙型肝炎、小细胞肺癌等，见图5。

图4 大黄疾病交集靶标基因本位功能富集分析

图5 大黄与疾病交集靶标京都基因与基因组百科全书通路富集分析

2.7 分子对接选取有效成分度值最高的β-谷甾醇、芦荟大黄素及与之对应的关键蛋白通过Autodock Vina 计算结合能（表2），可视化结果见图6。

图6 大黄有效成分与分子对接结合能最低的关键靶蛋白分子对接三维图：A为芦荟大黄素与热休克蛋白90α；B为芦荟大黄素与前列腺素内过氧化物合酶2；C为芦荟大黄素与胱天蛋白酶3；D为β-谷甾醇与胱天蛋白酶3；E为β-谷甾醇与热休克蛋白90α；F为β-谷甾醇与胱天蛋白酶8

表2 大黄活性成分与关键蛋白结合能∕kcal∕mol

3 讨论

大黄是治疗急性胰腺炎的传统中医药物，既可以单独使用，也可以联合使用。大黄进行口服或鼻饲可以缩短病人的腹部症状的持续时间、大便再通时间以及血和尿淀粉酶恢复时间，并降低IL-8、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平以及死亡率［1-2］。

大黄用以治疗胰腺炎时发挥治疗效果的活性成分，可能包括芦荟大黄素，泽兰黄醇、大黄酸、β-谷甾醇、决明内脂、儿茶素等［8］。其中，芦荟大黄素可下调AP 大鼠血清中血小板激活因子、IL-6、TNF-α浓度；调节Treg∕Th17 免疫细胞比例发挥治疗作用［2，9］。β-谷甾醇作为植物甾醇，具有降低血脂水平、退热消炎、抗氧化应激、抗肿瘤、增强免疫系统等作用［10-11］。决明内脂能抑制细菌中遗传物质的生物合成，对孢子菌、地丝菌等真菌有较强的抑制作用，同时可降血压、调血脂［12］。儿茶素可产生H2O2，上调katB、sodM 等基因，减轻氧化应激和DNA 受损对细胞的损伤［12］。泽兰黄醇具有明显的抗炎及神经细胞保护作用［13］。大黄酸可通过抑制核因子κB信号通路降低血清中IL-1β、IL-6和TNF-α 等炎性因子的浓度，抑制炎症活化因子转录，改善炎症反应引起的血管并发症［14］。

本研究进一步通过GO和KEGG分析后发现，大黄活性成分可能与分布在细胞不同部位的受体相互作用，进而参与多种生物过程、调控多种通路发挥作用。通过PPI，我们发现CASP8、HSP90AA1、caspase-3、TP53、MYC、CDKN1A、JUN、PTGS2 可能是大黄治疗急性胰腺炎的关键蛋白。其中芦荟大黄素可 能与CASP8、HSP90AA1、MYC、CDKN1A、JUN、PTGS2 受体蛋白相互作用；β-谷甾醇可能与CASP8、HSP90AA1、caspase-3、TP53、JUN 受体蛋白相互作用；且二者的分子对接能均＜-5 kcal∕mol。结合能表示蛋白受体与化合物结合是否稳定，结合能越低，结合活性越强。热休克蛋白（HSP）广泛存在各种生物细胞当中，当应激发生时，HSP 可大量表达、起到抗炎、抗细胞凋亡及抗氧化作用。急性胰腺炎中HSP90 的升高是诱发应激性溃疡的危险因素［15］。HSP90AA1 可以调节TNF-α 和IL-6 水平，且有研究提示，抑制HSP90AA1表达，可降低小鼠体内巨噬细胞炎症小体活性，减少炎性因子分泌［16］。PTGS2又称环氧合酶2（COX-2），调控其表达的水平可以改善疾病的炎症症状［17］。COX-2高表达与急性胰腺炎发生相关，COX-2 抑制剂可降低炎症细胞因子水平，进而减轻全身炎症反应并预防重症胰腺炎的发生［18］。JUN 参与激活蛋白-1 复合物的形成，后者可被大黄抑制，进而减少炎性因子TNF-α、IL-6 生成，发挥治疗作用［19］。Tp53 基因参与细胞凋亡，AP可致胰腺TP53表达量上调，加速了胰腺细胞坏死凋亡［20］。胱天蛋白酶8 是TNF 超家族成员，可与细胞膜表面的死亡受体信号通路结合形成多蛋白死亡诱导信号复合物，进而激活下游的凋亡执行因子caspase-3、诱导外源性刺激所致的细胞凋亡。AP 小鼠肠道中caspase-3 表达升高，大黄素可以下调该蛋白的表达，参与调节AP引起的肠道损伤［21］。

综上所述，大黄治疗AP 的作用机制可能与其活性成分芦荟大黄素、β-谷甾醇等与靶蛋白（HSP90AA1、PTGS2、CASP8、caspase-3 等）相互结合，进而通过多种途径发挥生物学作用。