基于血管紧张素Ⅱ/一氧化氮信号通路探究N-苄苯乙烯胺对妊娠期高血压模型大鼠的干预机制

刘艳，刘晓夏，朱一麟

作者单位：1武汉市第一医院妇产科，湖北 武汉 430022；2华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，湖北 武汉430022

妊娠期高血压（HDCP）是一种妊娠期女性特有疾病［1-3］。有研究表示，我国女性生育平均年龄呈现上升趋势，HDCP 发病率也一直居高不下，因此越来越多的专家学者致力于HDCP 临床治疗的研究［4-5］。有研究显示，酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）∕信号传导和转录激活因子3（STAT3）∕细胞因子信号转导抑制因子1（SOCS1）通路与细胞分化、血管内皮损伤等密切相关，血管内皮损伤在HDCP 的发生发展过程中发挥重要作用［6］。本研究于2021年1—5月设计、实施实验，建立HDCP 大鼠模型，使用JAK2 抑制剂N-苄苯乙烯胺（AG490）进行干预，观察干预效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 选取30只SD 健康雌性大鼠及10只SD 健康雄性大鼠［湖南中医药大学第一附属医院，使用许可证号：SYXK（湘）2020-0010］，周龄范围8～9 周，周龄（8.5±0.4）周；体质量范围219～237 g，体质量（228.2±7.2）g，在温度（24.1±2.8）℃环境中饲养，光照12 h∕d。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.1.2主要试剂 小鼠抗兔血肌酐、血尿素氮抗体（Hyclone 公司）；小鼠抗大鼠C 反应蛋白（CRP）抗体（BD 公司）；兔抗大鼠白细胞介素-1β（IL-1β）抗体（Selleck 公司）；大鼠抗小鼠血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、一氧化氮（NO）抗体（Dako 公司）；大鼠抗小鼠过氧化脂、过氧化氢酶（CAT）（Gibco 公司）；兔抗大鼠JAK2、STAT3 抗体（Sigma 公司）；小鼠抗兔SOCS1 抗体（Invitrogen公司）。

1.2 建模及分组自30只SD健康雌性大鼠中采用随机数字表法挑选10只雌鼠为正常组，不做任何处理。其余20 只雌鼠建立HDCP 模型：以2∶1 比例将20只雌鼠与10只雄鼠合笼过夜，次日清晨对雌鼠进行阴道涂片检查，发现精子即为孕鼠，未发现精子则继续与雄鼠合笼，直至检查发现阴道出现精子。所有大鼠于孕12 d 皮下注射125 mg·kg-1·d-1一氧化氮合成酶抑制剂，正常组大鼠皮下注射同剂量蒸馏水，孕鼠出现血压升高、蛋白尿情况为建模成功。使用随机数字表法将20 只HDCP 大鼠分为HDCP组、AG490 组各10 只，孕18 d 起，AG490 组大鼠腹腔注射5 mg∕kg AG490，正常组、HDCP 组大鼠腹腔注射等量生理盐水。三组大鼠均连续干预7 d。

1.3 指标检测

1.3.1血压水平检测 于大鼠受孕20 d 时使用微动脉血压检测仪检测大鼠尾动脉收缩压、舒张压水平，计算平均动脉压。所有大鼠在呼吸平稳状态下检测5次，取平均值。

1.3.2肾功能指标检测 取各组大鼠腹部静脉血3 mL，2 000 r∕min 离心15 min 后-40 ℃保存。免疫透射比浊法，340、700 nm 波长处测定免疫复合物浊度，计算血肌酐、血尿素氮水平。收集大鼠24 h 尿液，使用酶法检测各组大鼠24 h尿蛋白。

1.3.3酶联免疫吸附实验法检测炎症反应、氧化应激指标及AngⅡ、NO 水平 对酶标板进行标记，设置对照、标准、测定孔，对照孔加终止液、显色剂，标准孔内加入稀释后的标准品，测定孔内加血清及抗体，封膜后震荡均匀，使用37 ℃保温箱保存，1 h 后去膜清洗，将水分吸干后三孔均加入显色剂震荡，显色后添加终止液，450 nm 处测吸光值，计算CRP、IL-1β、过氧化脂、CAT、AngⅡ、NO水平。

1.3.4胎鼠情况观察 各组大鼠麻醉后进行剖宫产，取出胎鼠及胎盘组织，检测各组大鼠胎鼠体长、体质量及胎盘质量。

1.3.5蛋白质印迹法检测JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路蛋白相对表达量 取各组大鼠胎盘组织，提取50 μg 蛋白，煮至蛋白变性后进行SDS-PAGE 凝胶电泳处理，依据蛋白分子将凝胶切开、转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，封闭液（Western）室内封闭待测、内参蛋白，1.5 h 后添加待测蛋白抗体（1∶1 000）、内参抗体（1∶2 000），孵育24 h后取出，使用Western 洗涤液清洗5 次，添加山羊抗兔抗体（1∶5 000），Western 洗涤液洗涤后显色、曝光、成像，检测JAK2、STAT3、SOCS1相对表达量。

1.4 统计学方法使用SPSS 26.0 软件分析，计量资料采用描述，多组间比较采用方差齐性检验，进行单因素方差分析，组间采用LSD-t检验比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠血压、平均动脉压水平比较如表1所示，与正常组比较，HDCP 组、AG490 组大鼠血压、平均动脉压水平较高（P＜0.05）；与HDCP 组比较，AG490 组大鼠血压、平均动脉压水平较低（P＜0.05）。

表1 三组大鼠血压水平比较∕（mmHg，）

表1 三组大鼠血压水平比较∕（mmHg，）

注：①与正常组比较，P＜0.05。②与HDCP组比较，P＜0.05。

2.2 三组大鼠肾功能比较如表2 所示，与正常组比较，HDCP 组、AG490 组大鼠24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平较高（P＜0.05）；与HDCP 组比较，AG490 组大鼠24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平较低（P＜0.05）。

表2 三组大鼠肾功能比较∕

表2 三组大鼠肾功能比较∕

注：①与正常组比较，P＜0.05。②与HDCP组比较，P＜0.05。

2.3 三组大鼠炎症反应、氧化应激指标水平比较如表3所示，与正常组比较，HDCP组、AG490组大鼠CRP、IL-1β、过氧化脂水平较高，CAT 水平较低（P＜0.05）；与HDCP 组比较，AG490 组大鼠CRP、IL-1β、过氧化脂水平较低，CAT水平较高（P＜0.05）。

表3 三组大鼠炎症反应、氧化应激指标水平比较/

表3 三组大鼠炎症反应、氧化应激指标水平比较/

注：CRP为C反应蛋白，IL-1β为白细胞介素-1β，CAT为过氧化氢酶，HDCP为妊娠期高血压，AG490为N-苄苯乙烯胺。①与正常组比较，P＜0.05。②与HDCP组比较，P＜0.05。

2.4 三组大鼠胎盘质量、胎鼠体长、体质量比较如表4所示，与正常组比较，HDCP组、AG490组大鼠胎盘质量、胎鼠体长、体质量较低（P＜0.05）；与HDCP 组比较，AG490组大鼠胎盘质量、胎鼠体长、体质量较高（P＜0.05）。

表4 三组大鼠胎盘质量，胎鼠体长、体质量比较∕

表4 三组大鼠胎盘质量，胎鼠体长、体质量比较∕

注：HDCP为妊娠期高血压，AG490为N-苄苯乙烯胺。①与正常组比较，P＜0.05。②与HDCP组比较，P＜0.05。

2.5 三组大鼠AngⅡ、NO水平比较如表5 所示，与正常组比较，HDCP 组、AG490 组大鼠AngⅡ水平较高，NO 水平较 低（P＜0.05）；与HDCP 组比较，AG490 组大鼠AngⅡ水平较低，NO 水平较高（P＜0.05）。

表5 三组大鼠AngⅡ、NO水平比较/

表5 三组大鼠AngⅡ、NO水平比较/

注：AngⅡ为血管紧张素Ⅱ，NO 为一氧化氮，HDCP 为妊娠期高血压，AG490为N-苄苯乙烯胺。①与正常组比较，P＜0.05。②与HDCP组比较，P＜0.05。

2.6 三组大鼠JAK2/STAT3/SOCS1 通路蛋白表达比较与正常组比较，HDCP 组、AG490 组大鼠JAK2、STAT3、SOCS1 相对表达量较高（P＜0.05）；与HDCP 组比较，AG490 组大鼠JAK2、STAT3、SOCS1相对表达量较低（P＜0.05）。见表6，图1。

图1 三组大鼠JAK2、STAT3、SOCS1表达的蛋白质印迹法检测结果

表6 三组大鼠JAK2∕STAT3∕SOCS1通路蛋白表达比较∕

表6 三组大鼠JAK2∕STAT3∕SOCS1通路蛋白表达比较∕

注：JAK2 为酪氨酸蛋白激酶2，STAT3 为信号传导和转录激活因子3，SOCS1 为细胞因子信号转导抑制因子1，HDCP 为妊娠期高血压，AG490为N-苄苯乙烯胺。①与正常组比较，P＜0.05。②与HDCP组比较，P＜0.05。

3 讨论

HDCP 症状若得不到及时有效的控制，病情严重的病人甚至可能最终发展为多器官功能衰竭，严重威胁妊娠结局甚至孕妇生命安全［7-8］。药物治疗为常用的治疗HDCP 的手段，但是尚无一种特效的治疗HDCP 的药物，加之妊娠期的特殊性，导致HDCP 症状临床治疗难度较大［9-11］。本研究显示，HDCP大鼠血压、平均动脉压水平较高，使用AG490 干预的HDCP 大鼠血压、平均动脉压水平较低。有学者在研究中表示，随着HDCP的发生发展，血压水平出现一定程度的上升，抑制HDCP 病人血压水平上升对HDCP 病人妊娠结局的改善具有重要意义［12-13］。本研究结果说明，HDCP 大鼠血压水平异常升高，使用AG490 干预能够降低HDCP 大鼠血压水平，分析其原因可能是在AG490 的干预下，HDCP 大鼠平滑肌松弛，外周血管阻力下降，从而出现血压水平下降的结果。

本研究发现，HDCP 大鼠24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平相对较高，使用AG490 干预的HDCP大鼠24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平则相对较低。随着HDCP 的发展，机体肾功能会出现一定程度的损伤，改善肾功能在HDCP 病人病情恢复中具有重要作用［14-15］。24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮为常用的评价肾功能的指标。本研究说明，HDCP 大鼠肾功能出现损伤，在AG490的干预下，HDCP 大鼠肾功能损伤情况减轻，针对此研究结果，推测其原因可能是AG490干预起到了抑制HDCP大鼠钙离子内流、扩张平滑肌的作用，从而改善HDCP 大鼠肾功能。

本研究发现，HDCP 大鼠CRP、IL-1β、过氧化脂水平较高，CAT 水平较低，使用AG490 干预的HDCP大鼠CRP、IL-1β、过氧化脂水平下降，CAT 水平上升。有研究表示，HDCP 症状的发生发展伴随着一定程度的炎症反应、氧化应激反应［16-18］。CRP、IL-1β为广谱炎症指标，过氧化脂、CAT 常用于氧化应激反应的评价。本研究说明，HDCP 大鼠出现明显的炎症反应、氧化应激反应，在AG490 的干预下，HDCP 大鼠炎症反应、氧化应激反应严重程度减轻，说明AG490 干预能够通过减轻HDCP 大鼠炎症反应、氧化应激反应起到干预效果。

本研究发现，HDCP 大鼠AngⅡ水平相对较高，NO 水平相对较低，使用AG490 干预的HDCP 大鼠AngⅡ水平下降，NO 水平上升。HDCP 症状的发展伴随着机体血管内皮收缩、舒张功能障碍［19-20］。本研究说明，HDCP 大鼠血管内皮收缩、舒张功能出现明显异常，在AG490的干预下，HDCP 大鼠血管内皮功能得到有效提升。有学者通过动物实验研究表示，抑制JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路蛋白表达能够起到提升妊高症大鼠血管内皮功能的作用［21］。基于此，本研究对JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路蛋白进行检测，发现HDCP 大鼠JAK2、STAT3、SOCS1 相对表达量较高，使用AG490 干预的HDCP 大鼠JAK2、STAT3、SOCS1 表达下调，说明AG490 干预能够靶向调控JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路，从而达到改善大鼠内皮功能的目的。

综上所述，使用JAK2抑制剂AG490对HDCP模型大鼠进行干预，能够改善大鼠血压水平、肾功能水平，减轻炎症反应、氧化应激减轻，改善胎鼠状况，大鼠内皮功能得到提升，其原因可能是AG490能够调控JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路蛋白表达，为后续研究提供了一定的理论依据。