HLA-B*15∶02基因型的快速鉴别方法建立及临床应用*

初亚男,封利颖,李玉娇,张婕妤

中国人民解放军东部战区总医院临床药学科,江苏南京 210002

卡马西平是常用的抗癫痫药物,史蒂文斯-约翰逊综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)是这种药物可能引起的致死性皮肤不良反应。VigiBase数据库中单一药物引起 SJS 排名前三的药物中就包括苯妥英钠和卡马西平[1]。此外,奥卡西平作为卡马西平的酮基衍生物也会发生类似的严重不良反应。卡马西平、苯妥英钠、奥卡西平同属于芳香族类抗癫痫药物。近年发现携带人类白细胞抗原(HLA)-B*15∶02基因的亚洲人群服用上述药物发生SJS/TEN的风险显著高于不携带人群,因此,HLA-B*15∶02基因携带者应考虑避免使用上述3种药物作为替代药物[2]。常规的HLA分型方法有低分辨的聚合酶链反应-等位基因特异性引物法(PCR-SSP)[3]、聚合酶链反应-序列特异寡核苷酸探针法(PCR-SSOP)[4]及高分辨的聚合酶反应-直接测序法(PCR-SBT)[5]等,上述方法操作烦琐、需要专用软件、检测成本高、耗时长[6],陆续有研究人员发现可以用单核苷酸多态性位点(SNP)表征特定的HLA基因型。本研究拟采用操作简便、灵敏度高、无须荧光标记的焦磷酸测序法建立rs144012689位点多态性分析方法,分析其与Sanger测序、商品化试剂盒的一致性,并采用已确诊为SJS的病例进行验证,初步评估本研究建立的测序方法的临床适用性。

1 资料与方法

1.1一般资料 验证标本来源于本科室标本库中已完成HLA-B分型的40例患者的核酸标本(40份)及随机核酸标本(20份),采用中国台湾世基生物公司HLA-B位点 1502 基因检测试剂盒(简称世基试剂盒)完成检测的核酸标本40份。2019-2021年在本院确诊为芳香族类抗癫痫药物诱发的SJS不良反应患者2例。

1.2仪器与试剂 焦磷酸测序试剂盒及缓冲液购自德国QIAGEN公司,HLA-B位点 1502 基因检测试剂盒购自中国台湾世基生物公司,Taq酶购自日本TaKaRa公司,全血基因组提取试剂盒购自美国Promega公司,实验用水为灭菌蒸馏水,其他试剂均为分析纯。Q24焦磷酸测序仪购自德国QIAGEN公司,SLAN96S实时荧光定量PCR仪购自上海宏石公司,A200基因扩增仪购自杭州朗基科学仪器公司,微量紫外分光光度计购自南京伍义公司。

1.3方法

1.3.1全血基因组DNA提取 本研究采用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取全血中基因组DNA,对提取的基因组DNA进行纯度和浓度测定,确保A260/A280在1.8～2.0,按照说明书将世基试剂盒检测的基因组DNA标本的质量浓度控制在12.5～50.0 ng/μL。

1.3.2焦磷酸测序引物的设计和合成 采用Assay Design Software 2.0进行引物设计,使用Primer 5.0进行筛选,所有引物由Invitrogen公司合成,引物序列见表1。

表1 rs144012689位点的焦磷酸测序引物

1.3.3PCR体系优化和焦磷酸测序 PCR反应体系和焦磷酸测序方法参考作者已发表的文章所述[7]。测序推注碱基的顺序为“GTAGCA”,其中第2个碱基“T”为rs144012689位点的野生信号峰,第3个碱基“A”为rs144012689位点的突变信号峰,根据测序图谱“A”信号峰的有无判别是否携带HLA-B*15∶02基因。将引物组进行配对后,根据单碱基峰高和比例筛选最佳引物。分别考察55 ℃、60 ℃、65 ℃退火温度下的扩增效率,根据单碱基峰高评价最适的退火温度。梯度稀释人基因组DNA至10.0 ng/μL、2.0 ng/μL、0.4 ng/μL及空白对照4个梯度平行扩增并测序3次,根据单碱基峰高和比例评价本方法的检测限。

1.3.4灵敏度和特异度考察 HLA-B基因PCR-SBT高分辨分型是鉴别该基因分型的金标准。为了评价本研究建立的rs144012689位点焦磷酸测序法表征HLA-B*15∶02基因型的性能。对40份已完成HLA-B基因PCR-SBT高分辨分型的标本采用焦磷酸测序检测进行rs144012689位点检测,评估rs144012689位点的灵敏度(采用焦磷酸测序检测rs144012689正确判定检测标本含有HLA-B*15∶02基因型的比例)和特异度(采用焦磷酸测序检测rs144012689正确判定检测标本不含有 HLA-B*15∶02基因型的比例)。

1.3.5焦磷酸测序与Sanger测序和商品化试剂盒的一致性评价 本研究使用的焦磷酸测序技术属于边合成边测序的酶联级联测序技术,Sanger测序基于双脱氧链终止法进行测序属于一代测序,是验证测序结果准确性的金标准。因此本研究从标本库中选择20份标本,同时采用焦磷酸测序和Sanger测序对rs144012689位点进行检测,比较两种测序方法的一致性。选择标本库中的40份标本,按照世基试剂盒说明书要求进行HLA-B*15∶02基因检测,同时将40份标本进行焦磷酸测序,比较本研究建立方法与商品化试剂盒检测的一致性,将筛查出的阳性标本外送进行HLA-B基因的高分辨分型,检测结果使用Kappa分析进行一致性评价。

1.3.6建立的方法对SJS综合征患者的临床应用 收集本院2019-2021年确诊为芳香族类抗癫痫药物所致SJS的患者,同步进行PCR-SBT分型和rs144012689位点焦磷酸测序检测。评价本方法对确诊病例的检出性能。

2 结 果

2.1PCR体系优化结果 根据单碱基峰高和测序峰比例筛选出上游引物1、下游引物1、测序引物2为最优引物组,55 ℃、60 ℃、65 ℃退火温度下,单碱基峰高分别为240 mV、275 mV和170 mV,因此60 ℃为最佳退火温度。本方法的检测限为0.4 ng/μL,见图1。

注:图中灰色区域为 SNP 的判别区域。

2.2灵敏度和特异度结果 40份标本中,HLA-B高分辨分型含有HLA-B*15∶02型的标本有2份,分别为HLA-B*15∶02及HLA-B*44∶03型标本1份和HLA-B*15∶02及HLA-B*51∶01型标本1份,不含有HLA-B*15∶02型的标本有38份,包括与HLA-B*15∶02型相近的HLA-B*15∶01型、HLA-B*15∶11型、HLA-B*15∶18等型别。焦磷酸测序结果为TA型的标本有2份,TT型标本有38份,见表2。表明使用rs144012689位点表征HLA-B*15∶02基因型的灵敏度和特异度均为100%。

表2 40标本焦磷酸测序和HLA-B高分辨分型结果(n)

2.3一致性评价结果 20份标本rs144012689位点Sanger测序和焦磷酸测序检测得到TT型16份,TA型4份,2种方法一致性比较的Kappa值为1,见表3;40份标本焦磷酸测序结果显示有4份为TA型,与商品化试剂盒检测出的4份阳性标本一致;2种方法一致性比较的Kappa值为1,见表4。2019-2021年共计对89例考虑服用芳香族类抗癫痫药物和已经发生药物性皮炎(药疹)的患者进行rs144012689位点的检测,共计筛查出12份“A”型基因携带者,其中2例为SJS确诊患者,1例为服用卡马西平后诱发的药疹,1例有奥卡西平过敏史,在服用丙戊酸钠和托吡酯时发生了交叉过敏反应[8],2例患者rs144012689位点检测结果为TA型。将上述10份TA型标本外送进行HLA-B基因的高分辨分型,结果显示10份标本均含有HLA-B*15∶02基因型。上述验证结果说明本研究建立的方法与另外两种方法的一致性良好,具有良好的临床应用潜力。

表3 20标本焦磷酸测序和Sanger测序结果(n)

表4 40标本焦磷酸测序和世基试剂盒结果(n)

3 讨 论

我国已经在一些地区施行了按疾病诊断相关分组(DRGs)完成支付的试点改革,对细化临床用药方案,提升合理用药水平和提高医疗质量做出了更高的要求。药物的不良反应是造成患者住院时间延长、住院和药品费用增加的重要因素[9]。用药前进行HLA-B*15∶02基因型筛查将为避免不良反应发生,降低患者治疗成本,实现个体化给药提供技术支撑。本研究结果表明,rs144012689位点“A”等位基因与HLA-B*15∶02基因型存在100%的连锁关系,与前期中国香港汉族人群和美国亚洲人群中的研究结果(96.7%～100.0%)相近[10-11]。因此,可以使用rs144012689位点的分型检测代替传统的HLA分型方案。rs144012689位点附近的rs2596496多态性会影响rs144012689位点的分型结果,尤其干扰以杂交原理为基础的TaqMan探针法、芯片法等技术的灵敏度和特异度,直接测序可以克服这一缺点,常见的一代测序方法中焦磷酸测序法因其操作简单、检测时间短、通量高的优点更适用于SNP分型。本研究基于焦磷酸测序建立的rs144012689位点检测方法,检测限低至0.4 ng/μL基因组DNA,高于商品化试剂盒的12.5～50.0 ng/μL基因组DNA,检测时间从获得标本采集到测序完成仅需要3 h,远低于HLA高分辨分型3～5 d的检测时间,与HLA高分辨分型和HLA-B位点基因检测试剂盒阳性和阴性的筛查结果一致。该方法较高分辨分型方法[12]的检测成本低,是实现成本效益优势的一个可行手段。但是本研究也存在一些不足,需要进一步增加样本量和阳性病例数对本方法的检测性能进行进一步评价。