基于RNA-seq 探讨扶肾降浊方及蚓激酶对肾间质纤维化的作用机制

王超坤，刘婷婷，帅一尘，李春雨，苏玮莲，宁志芬，李国霞

（天津医科大学基础医学院药理学系，天津 300070）

肾间质纤维化（renal fibrosis，RF）是各种慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）进展至肾功能衰竭的共同途径[1]。RF 是CKD 进展的标志，RF 进展与肾功能恶化密切相关[2]。在持续的慢性炎症过程中，肾小管上皮细胞发生了上皮-间充质转化（epithial-mesenchymal transition，EMT），同时，肌成纤维细胞的形成，造成细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）产生过多，降解减少，过量的ECM 沉积，损害了肾实质，导致RF 发生[3-4]。目前导致ECM 积聚的确切机制及基因调控靶点尚不十分清楚，西医尚无治疗肾纤维化的有效治疗措施[5]。

课题组前期对扶肾降浊方、蚓激酶治疗肾纤维化分别进行了多项研究，结果表明，扶肾降浊方、蚓激酶对肾纤维化均具有很好的治疗作用[6-7]，但扶肾降浊方、蚓激酶治疗肾纤维化的各自优势及联合用药是否具有协同作用尚不十分清楚。本研究旨在以往研究基础上，对扶肾降浊方、蚓激酶及联合用药治疗肾纤维化的作用优势、作用基因靶点及相关机制做进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 动物 SPF 级Sprauge-Dawley（SD）雄性大鼠60 只，体重190～210 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，动物合格证书编号：SCXK（京）2019-0010，常规饲养，动物房温度23℃，湿度40%，光照和黑暗按12 h 循环交替，自由饮水，自由获取饲料。经适应性喂养1 周后开始实验。动物实验方案经天津医科大学动物伦理委员会批准（编号：TMUaMEC 2022005）。

1.1.2 药物与试剂 扶肾降浊方组成：山茱萸12 g，生黄芪30 g，白花蛇舌草30 g，丹参30 g，鬼箭羽30 g，益母草30 g，由天津药物研究院中药现代研究部按既定工艺制备成浓缩剂，每克含生药量为3.32 g。蚓激酶肠溶液胶囊购自北京百奥药业有限公司（批号：H11021129）。大鼠的给药剂量按70 kg人体表面积换算[8]。根据前期实验结果，扶肾降浊方、蚓激酶在高剂量时抑制RF 的效果最佳[7，9]，故本实验采用高剂量。抗体β-actin、α-SMA，abcam公司（批号：ab8226、ab7817）；抗体Collagen-1，Affinity 公司（批号：AF7001）；抗体Vimentin、纤连蛋白（Fibronectin）、Flna、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）、细胞外信号调节激酶（ERK），Immunoway 公司（批号：YT4879、YT1733、YT1625、YT3569、YT1625、YP0101）；E-cad、兔抗IgG，Saierbio 公司（批号：SRP05266、SRPGAR001）。苏木素，上海源叶生物科技有限公司（批号：S19007）；水溶性伊红染色液，北京鼎国昌盛生物技术有限公司（批号：AR-0733）；Masson 三色染色液，索莱宝生物科技有限公司（批号：G1340）。

1.1.3 仪器 细胞培养箱，美国Thermo 公司（型号：YZB/USA1802-2009）；正置显微镜，日本尼康株式会社（型号：LV150NL）；电泳仪，中国北京六一生物科技有限公司（型号：DYCP-31BN）；组织脱水机，德国Leica 公司（型号：TP1020）；加热石蜡包埋机，德国Leica 公司（型号：EG1150C）；手动轮转式切片机，德国Leica 公司（型号：RM2235）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备 大鼠经适应性喂养1 周后采用如下方法对其进行肾间质纤维化造模：大鼠全麻诱导后，在模型组大鼠腹部正中切开，露出左肾，在上、下1/3 处结扎左输尿管，两次结扎点之间切断输尿管，切口用5-0 线缝合，在伤口处涂碘伏消毒[10]。假手术组大鼠采用相同的手术方式但不结扎输尿管。除假手术组外，其余各组大鼠均进行肾间质纤维化造模。

1.2.2 分组与干预 将大鼠随机分为假手术组、模型组、扶肾降浊方组、蚓激酶组和联合用药组，每组12只。对假手术组大鼠进行输尿管游离，对其他组大鼠进行肾间质纤维化造模。造模后第2 天开始给药，扶肾降浊方灌胃给药：29 g/（kg·d），蚓激酶腹腔注射给药：360 000 U/（kg·d），假手术组、模型组给予等体积生理盐水，每天给药1次。术后第7 天及14 天各组分别处死6 只大鼠。在无菌操作台上迅速打开腹腔，在距肾门1 mm 切取左侧梗阻肾脏，用生理盐水冲洗后，沿矢状面切开，分为等量的两份，分别放入无菌微型离心管中，一份用液氮快速冷却后保存于-80℃冰箱，用于Western 印迹实验，另切取黄豆大小组织用于转录组测序，一份放入4%多聚甲醛液固定24 h，用于病理学实验。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 肾组织病理学评估：肾脏标本在4%多聚甲醛液中固定24 h，常规修块，脱水，浸蜡，包埋，将样品切成4 μm 厚的切片，HE 染色观察肾脏皮质、髓质和肾小管等情况；Masson 染色观察胶原纤维分布情况。在光学显微镜下观察Masson 三色染色切片，并在200×放大镜下拍照。从整个切片中选取5 个视野，蓝染面积百分比计算为总阳性面积/总分析面积的百分比。

1.2.3.2 分析各治疗组差异表达基因：取给药7 d 时的模型组及治疗组大鼠的肾脏组织，切取黄豆大小样本，每组设置两个生物学重复，转移到离心管中送至中国华大生物科技公司进行测序分析，进行RNA 的提取与检测、反转录、PCR 富集、构建文库，最后上机检测。分析扶肾降浊方组、蚓激酶组及联合用药组相比模型组差异表达的基因。

1.2.3.3 Western 印迹：检测梗阻侧大鼠肾组织PAI-1、Collagen-1、Fibronectin、E-cad、α-SMA、Vimentin、Flna、ERK 和p-ERK 的表达，取肾组织标本加入预冷的RIPA 裂解缓冲液，研磨后静置于冰上裂解60 min，4℃，12 000×g 离心，取上清。BCA 法测定蛋白浓度。10%SDS-PAGE 胶进行电泳蛋白分离，并将目的蛋白转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h后，将膜与一抗PAI-1、Collagen-1、Fibronectin、Ecad、α-SMA、Vimentin、Flna、p-ERK 和ERK，浓度均为1：1 000，β-actin（1∶10 000）4℃孵育过夜。用TBST 洗膜4 次，每次5 min。将印记与耦联于辣根过氧化物酶的二抗[羊抗兔IgG（1∶10 000）]室温孵育2 h。用TBST 洗膜4 次，每次5 min。按ECL 试剂盒说明进行显影，用X 感光胶片在暗室内进行曝光。以β-actin 为内参进行条带灰度分析。将目标条带与参考条带的灰度比值作为蛋白的相对表达，用Image J 14.1 软件进行图片处理。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0 软件对数据进行统料计用分析表，符示合，各正组态间分比布较或采近用似单因正素态方分差布分的析计，量两资两比较采用t 检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾脏病理组织形态学

2.1.1 HE 染色 假手术组肾小管结构正常，排列整齐紧密，未见扩张或萎缩，未见间质炎症细胞浸润。模型组肾小管上皮细胞肿胀脱落、变性坏死，致结构被破坏，伴有炎症细胞浸润，随造模时间地延长，模型组纤维化程度进一步加重。扶肾降浊方、蚓激酶和联合用药均可不同程度地减轻肾纤维化。第7 天，扶肾降浊方组纤维化减轻更为突出，随着纤维化程度的加重，扶肾降浊方组作用减弱，到第14 天时，蚓激酶组纤维化改变较扶肾降浊方组轻。此外，第7、14 天，均以联合用药效果最佳，见图1。

图1 各治疗组术后7 d，14 d 肾脏病理改变(HE 染色，200×)Fig 1 Renal pathological changes in 7 d，14 d among groups (HE staining，200×)

2.1.2 Masson 染色 假手术组肾小管周围间质未见蓝色胶原纤维沉积；模型组间质可见较多蓝色胶原纤维染色，且随造模时间地延长蓝染面积进一步加重（P＜0.01）。与模型组比较，扶肾降浊方组、蚓激酶和联合用药组纤维化蓝染面积均有不同程度的减轻（P＜0.01 或P＜0.05）。第7 天，与蚓激酶组相比，扶肾降浊方组纤维化蓝染面积明显降低（P＜0.01）。第14天，蚓激酶组较扶肾降浊方组纤维化蓝染面积降低（P＜0.05）。两个时间段均以联合用药后纤维化蓝染面积最小（P＜0.05 或P＜0.01），见图2。

图2 各组肾脏病理改变（Masson 染色，200×）Fig 2 Renal pathological changes in each group（Masson staining，200×）

2.2 各组大鼠ECM 相关蛋白表达 通过检测ECM 标志物PAI-1、Collagen-1 和纤连蛋白的表达量进一步了解药物对RF 中ECM 异常积聚的作用。与假手术组相比，模型组PAI-1、Collagen-1 和纤连蛋白的表达量明显增加（P＜0.01）。扶肾降浊方组、蚓激酶组及联合用药组可显著降低PAI-1、Collagen-1 和纤连蛋白的表达（P＜0.01 或P＜0.05）。第7 天，相比蚓激酶组，扶肾降浊方组PAI-1、Collagen-1 和纤连蛋白的表达量较低（P＜0.01 或P＜0.05）。第14 天，蚓激酶组PAI-1、Collagen-1 和纤连蛋白的表达量较扶肾降浊方组低，但无统计学意义（P＞0.05）。两个阶段均以联合用药PAI-1、Collagen-1 和纤连蛋白的表达量最低（P＜0.01 或P＜0.05），见图3。

图3 各组PAI-1、Collagen-1 和Fibronectin 蛋白表达Fig 3 The expression of PAI-1,Collagen-1and Fibronectin in each group

2.3 各组UUO 大鼠EMT 相关蛋白表达 通过检测EMT 标志物E-cad、α-SMA、Vimentin 蛋白的表达量进一步了解药物对RF 中EMT 的作用。与假手术组相比，模型组α-SMA 和Vimentin 的表达量明显增加，E-cad 的表达量明显降低（P＜0.01）。扶肾降浊方组、蚓激酶组及联合用药组可显著降低α-SMA 和Vimentin 的表达，促进E-cad 的表达（P＜0.01 或P＜0.05）。第7 天，相比蚓激酶组，扶肾降浊方组α-SMA 和Vimentin 的表达较低，E-cad的表达较高（P＜0.01）。第14 天，蚓激酶组α-SMA和Vimentin 的表达较扶肾降浊方组低，E-cad 的表达较扶肾降浊方组高（P＜0.01 或P＜0.05）。第7、14 天均以联合用药组α-SMA 和Vimentin 的表达量最低，E-cad 的表达量最高（P＜0.01 或P＜0.05），见图4。

图4 各组α-SMA、Vimentin 和E-cad 蛋白表达Fig 4 The expression of α-SMA,Vimentin 和E-cad in each group

2.4 模型组和给药组大鼠基因转录本差异表达情 况 与模型组相比，扶肾降浊方组有136 个转录本差异表达，蚓激酶组有836 个转录本差异表达，扶肾降浊方联合蚓激酶组有1 011 个转录本差异表达。笔者选取了这3 个区间的交集，共30 个转录本。与模型组相比，相对于其他转录本，Flna 在3 个治疗组中均明显降低，见图5。

图5 针对模型组和治疗组的转录组测序分析Fig 5 Transcriptome sequencing analysis for model group and treatment group

2.5 各组大鼠Flna 基因表达量及ERK 信号通路 与假手术组相比，模型组Flna 和p-ERK 蛋白的表达量明显增加（P＜0.01）。扶肾降浊方、蚓激酶及联合用药可显著降低Flna 和p-ERK 蛋白的表达（P＜0.01或P＜0.05）。第7 天，与蚓激酶组相比，扶肾降浊方组Flna 和p-ERK 蛋白的表达量较低（P＜0.05）。第14 天，蚓激酶组Flna 和p-ERK 蛋白的表达量较扶肾降浊方组低（P＜0.01 或P＜0.05）。第7、14 天均以联合用药组Flna 和p-ERK 蛋白的表达量最低（P＜0.01 或P＜0.05），见图6。

3 讨论

肾间质纤维化是慢性肾病严重程度的重要标志[11]，也是临床上治疗和预防进展性慢性肾病的关键。肾间质纤维化的病理特征是ECM 合成增多与降解减少，表现为细胞与基质相互作用失调，炎性细胞浸润和固有细胞转化[12-13]，而ECM 的合成与降解是一个复杂的调控体系，目前，对ECM 调控机制的认知并不十分清楚，如ECM 来源途径存在争议、各种细胞因子及其形成信号通路的作用机制尚未完全阐明。其中，细胞EMT 是组织发生纤维化的一种重要方式，在EMT 过程中，上皮细胞向间充质细胞转分化，其主要特征是上皮表型的破坏和间质表型的获得[14]。E-cad 参与上皮细胞的黏附，其表达的减少导致上皮细胞特性的丧失，活化的成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，其可表达α-SMA[15-16]。Vimentin 是间充质细胞骨架蛋白的重要组成部分[17]。由此，E-cad 表达的减少而Vimentin 和α-SMA 表达的增加被认为是EMT 的特征[18-19]。

文献报道Flna 是一种非肌性肌动蛋白结合蛋白，广泛存在于细胞浆，少数跨膜或存在于细胞核内，在细胞黏附、ECM 重塑以及细胞骨架重建中发挥重要作用，在肺癌细胞中，它促进TGF-β 诱导的EMT 进程[20]。Flna 可以通过促进MAPK 家族中ERK的磷酸化从而激活ERK 信号通路，而ERK 信号通路与纤维化密切相关。有文献报道，Flna 作为中央调节器在平衡ECM 的产生和重塑中起重要作用，可能通过激活RAS/MEK/ERK 信号通路而实现的[21-22]。

本研究表明，扶肾降浊方、蚓激酶及联合用药对RF 具有显著疗效，建模7 d 治疗组疗效优于建模14 d，以中药组及联合用药组作用更为突出，随着纤维化程度的加重，中药组作用减弱，蚓激酶组及联合用药组作用明显，提示早期进行药物干预，尤其是中药干预，治疗效果较好，且联合用药在各期效果均优于单独用药。

为进一步阐明药物作用机制，课题组采用转录组测序技术，在UUO 大鼠模型中分析扶肾降浊方、蚓激酶及联合用药调控RF 所涉及的基因表达差异，结果显示，相比模型组，扶肾降浊方、蚓激酶及联合用药组转录本Flna 的表达均显著降低，同时Flna 蛋白表达也均明显降低，推测Flna 可能在RF 中发挥核心调控作用，扶肾降浊方与蚓激酶可能通过调控共同基因靶点Flna 而起到治疗RF作用。

研究表明，Flna 是ECM 合成和重塑的中心调节因子，在ERK 和Smad 的激活中起平衡作用[23]，而Flna 的下游信号通路—RAS/MEK/ERK 可调控肾纤维化[24]。本研究发现，扶肾降浊方、蚓激酶及联合用药引起Flna 降低的同时造成Collagen-1、PAI-1、FN、α-SMA、Vimentin、p-ERK 蛋白的明显减少，E-cad 蛋白明显升高，推测药物可能通过调控Flna基因抑制ERK 的磷酸化水平、抑制表型转化、减少ECM 积聚而起到治疗RF 作用，进一步证明联合用药优势，为RF 的治疗提供科学依据。