短链脂肪酸对肝细胞糖脂代谢调节的作用机制研究

孙亚朝,邓邦利,牛文彦

（天津医科大学基础医学院免疫学系，天津 300070）

近年来，随着人们生活方式和饮食习惯的改变，糖尿病在全球的流行趋势越来越严峻。据相关组织预测，全球约有5.37 亿成年人患有糖尿病，预计到2030 年，这一数字将增至6.43 亿，到2045 年将达到7.83 亿[1]。其中2 型糖尿病患者约占所有糖尿病病例的90%，胰岛素抵抗是其重要诱因。胰岛素抵抗时，主要的胰岛素靶组织对胰岛素的敏感性降低，胰岛素信号转导减弱和生物作用受损[2]。肝脏是胰岛素的重要靶组织，其代谢异常与胰岛素抵抗和2 型糖尿病的发生、发展密切相关。餐后血糖升高促进胰岛素分泌，胰岛素通过血液循环到达肝脏，与肝细胞表面受体结合激活胰岛素信号通路，促进肝细胞摄取葡萄糖并转换为肝糖原储存，达到降低血糖的作用。肥胖时脂质在肝脏积聚诱发胰岛素抵抗，胰岛素调节肝脏糖脂代谢能力减弱[3]。因此，靶向调节肝脏糖脂代谢，改善胰岛素抵抗，是预防和控制2 型糖尿病发生、发展的关键治疗策略。

肠道菌群由多种微生物组成，并且是一个较复杂的生态系统，包含250 多种细菌、真菌、病毒等，他们可与宿主共生[4-5]。这些微生物在肠道中产生的大量小分子可调节机体代谢，维持机体代谢平衡[6]。生理状态下，潜在致病和非致病微生物之间存在平衡，这有助于维持肠道功能和宿主健康。然而，不利的外部刺激可改变参与疾病发病机制的肠道菌群的组成[7-8]，引起肠道菌群代谢物产生的异常，导致代谢异常，涉及胰岛素抵抗。肠道菌群代谢产物，包括短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）和氨基酸衍生物等，其中SCFAs，主要包括乙酸、丙酸和丁酸[9]。SCFAs 如何影响肝脏糖脂代谢的机制还未完全阐明。本研究用不同的SCFA 孵育小鼠肝细胞，检测对糖脂代谢的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 AML12 小鼠肝细胞株（厦门大学林圣彩院士惠赠）、胎牛血清、DMEM/F12 培养基、Hank's 平衡盐溶液（Hank's Balanced Salt Solution,HBSS）（美国GIBCO 公司），蛋白酶抑制剂、乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠（美国Sigma 公司），抗Actinin-1 抗体（中国Absin 公司），牛血清白蛋白（中国鼎国生物技术公司），抗β-actin 抗体、抗磷酸化Akt、AMPK、GSK-3β 和ACC 抗体以及AMPK 总蛋白抗体（美国CST 公司），Tannon-5200 化学发光成像系统（北京原平皓生物技术有限公司），增强化学发光底物检测试剂盒、0.45 μm 孔径的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、二辛可宁酸(bicinchonininc acid，BCA) 蛋白浓度测定试剂盒和RIPA 细胞裂解液（美国Millipore 公司）。山羊抗小鼠抗体、耦联辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体（美国Jackson Immuno Research 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 在37°C、5%CO2条件下用含10% 胎牛血清的DMED/F12 培养基培养AML12小鼠肝细胞，接种于75 cm 的细胞培养瓶中，隔天传代后，将细胞接种于12 孔培养板中。待细胞培养板中的细胞密度达到70%时将1、2、4、8 和16 mmol/L 浓度的乙酸、丙酸和丁酸的钠盐分别作用于细胞24 h。

1.2.2 Western 印迹检测 将配置好的含1 mmol/L Na3VO4、0.5 mmol/L NaF、1 μmol/L PIC 和200 mmol/L PMSF 的RIPA 细胞裂解液4℃预冷。弃去已处理好的12 孔板中细胞的上清液，4℃预冷的HBSS 缓冲液快速洗清细胞两次，弃去上清液，细头吸管吸去残留液，接着将培养板置于冰上。将预冷的RIPA 细胞裂解液按每孔200 μL 的量加入培养板中，冰上静止20 min，并收集。将收集的裂解液在4℃环境下以13 000 r/min 的转速离心20 min，取上清，BCA法检测蛋白浓度。加入LSB，100℃金属浴温度下5 min 备用。配置10%的聚丙烯酰胺凝胶，待凝胶凝固后装置在电泳槽中，加入蛋白样品，先80 V 电压电泳0.5 h，再以110 V 的电压电泳1 h 后，将载有蛋白的聚丙烯酰胺凝胶等组成“三明治”，并放置于转膜夹中，在恒电压下转膜2 h，小刀切取已转移到PVDF 膜上的目的蛋白的相应条带，接着用3%牛血清白蛋白室温封闭目的条带2 h 后，分别用不同的一抗4℃在摇床上孵育目的条带过夜后，洗膜液洗膜4 次，每次15 min。接下来将目的条带置于相应二抗中室温下摇床上孵育2 h，洗去膜上未结合的二抗。曝光机下检测各条带信号，Image J 软件定量分析。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism6 统计软件。用Shapiro-Wilk 检验对计量资料进行正态性检验，符合正态性分布的资料采用，用独立样本t检验比较组间差异；非正态性分布资料采用非参数Wilcoxon 秩和检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCFAs 对Akt 磷酸化的影响 本部分分别用1、2、4、8 和16 mmol/L 的乙酸、丙酸和丁酸的钠盐作用于AML12 细胞24 h，Western 印迹检测Akt 的磷酸化水平。结果如图1，乙酸钠不影响Akt 的磷酸化（图1A），而16 mmol/L 丙酸钠显著升高Akt 磷酸化水平，为对照组的（1.56±0.09）倍（F=3.251，P＜0.05）（图1B），8 mmol/L 和16 mmol/L 的丁酸钠显著增加Akt 的磷酸化，分别为对照组的（1.66± 0.18）倍（F=8.249，P＜0.05）和（2.00±0.16）倍（P＜0.01，图1C）。

图1 AML12 细胞中Akt pS473 磷酸化水平Fig 1 The levels of Akt pS473 in AML12 cells

2.2 SCFAs 对GSK-3β 磷酸化的影响 本部分同2.1 处理细胞，检测磷酸化的GSK-3β。结果显示，GSK-3β 的磷酸化水平不受乙酸钠的影响（图2A），丙酸钠作用下，GSK-3β 磷酸化水平呈无显著性升高（图2B），而8 mmol/L 的丁酸钠显著升高GSK-3β磷酸化水平，为对照组的（1.61±0.14）倍（F=4.690，P＜0.05，图2C）。

图2 AML12 细胞中GSK-3β pS9 磷酸化水平Fig 2 The levels of GSK-3β pS9 in AML12 cells

2.3 SCFAs 对AMPK 磷酸化的影响 同2.1 处理细胞，Western 印迹检测AMPK 的磷酸化水平和总蛋白表达。结果显示，乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠在不影响AMPK 总蛋白表达的情况下，不同程度的上调AMPK 的磷酸化水平。当乙酸钠浓度在2 mmol/L 时即可显著升高AMPK 磷酸化水平，为对照组的（1.40±0.13）倍（F=4.720，P＜0.05），4 mmol/L 时达最高水平（1.71±0.14）倍（P＜0.01，图3A）。丙酸钠在浓度为1 mmol/L 时即显著增加AMPK 的磷酸化水平，为对照组的（1.66±0.18）倍（F=16.54，P＜0.05），8 mmol/L 时达最高水平（2.45±0.09）倍（P＜0.001，图3B）。浓度为2 mmol/L 的丁酸钠即可显著磷酸化AMPK，为对照组的（1.70±0.13）倍（F=23.50，P＜0.05），8 mmol/L 时达最高水平（2.40±0.16）倍（P＜0.001，图3C）。

图3 AML12 细胞中AMPK pT172 磷酸化水平Fig 3 The levels of AMPK pT172 in AML12 cells

2.4 SCFAs 对ACC 磷酸化的影响 同2.1 处理细胞，Western 印迹检测ACC 的磷酸化水平。结果发现乙酸钠在浓度为16 mmol/L 时可显著磷酸化ACC，此时其磷酸化水平为对照组的（2.01±0.30）倍（F=4.807，P＜0.01，图4A）。4 mmol/L 丙酸钠显著升高ACC 的磷酸化，为对照组的（1.66±0.18）倍（F=7.507，P＜0.05），16 mmol/L 时达最高水平（1.93±0.05）倍（P＜0.01，图4B）。丁酸钠在浓度1 mmol/L时即可显著升高ACC 磷酸化水平，为对照组的（1.79±0.06）倍（F=7.028，P＜0.01），8 mmol/L 时达最高水平（1.94±0.14）倍（P＜0.01，图4C）。

图4 AML12 细胞中ACC pS79 磷酸化水平Fig 4 The levels of ACC pS79 in AML12 cells

3 讨论

机体胰岛素抵抗时通常伴随着2 型糖尿病的发生、发展，此时机体糖脂代谢紊乱，胰岛素调节靶组织信号分子的效应减弱。肠道菌群失调与胰岛素抵抗和2 型糖尿病相关，与肠道菌群中的产丁酸菌产生的SCFA 有关，SCFA 由丁酸菌在肠道中通过发酵膳食纤维产生[7,10-12]。2 型糖尿病患者体内产SCFA的丁酸梭菌菌群数量有所下降，在接受正常个体移植的粪便后，肠道内产生SCFA 的细菌成分增加，外周胰岛素抵抗显著改善[13]，提示SCFA 可能参与了机体糖脂代谢调节。

肝脏是机体葡萄糖和脂质代谢的主要场所，对维持全身血糖和血脂稳态起重要作用。肝细胞既能消耗葡萄糖，又能产生葡萄糖，血糖浓度决定了肝脏代谢葡萄糖的方式。餐后血糖升高，胰腺分泌胰岛素，肝细胞在胰岛素刺激下通过葡萄糖转运蛋白2（glucose transporter 2，GLUT2）摄取葡萄糖。肝细胞中葡萄糖的摄取主要依赖肝细胞膜表面的GLUT2，其介导的肝脏葡萄糖摄取效率较高，当肝脏细胞内葡萄糖浓度高于30 mmol/L 时达到饱和状态从而开始限制葡萄糖的摄取[14]。随后在糖原合酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）作用下，进入肝细胞的葡萄糖通过一系列生化反应生成肝糖原，这有助于肝脏继续摄取葡萄糖，从而降低血糖。在哺乳动物中，GSK-3 有GSK-3α 和GSK-3β两种亚型，其中GSK-3β 在肝细胞中作用于糖原合酶（glycogen synthetase，GS），使其被激活，进而促进葡萄糖转化为糖原[15]。GSK-3 在未磷酸化时处于激活状态，磷酸化后失活[16]。基础状态下，GS 的S657 磷酸化位点被酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化，接着在GSK-3 调节下磷酸化GS 的S653、S649、S645 和S641 位点，从而使GS 失活[17-18]。GSK-3 参与胰岛素作用下的肝糖原合成，此条件下其受上游分子Akt的调节。Akt 是重要的胰岛素信号分子，介导胰岛素调节肝脏糖代谢的作用，胰岛素抵抗时其磷酸化水平降低[19]。胰岛素通过胰岛素信号通路IRS-1/PI3K的信号转导磷酸化Akt，接着GSK-3β S9 和GSK-3α S21 在Akt 的调节下被磷酸化进而使GSK-3 瞬时失活，失活的GSK-3 促进糖原合成酶累积，导致肝细胞内过量的葡萄糖转化为肝糖原，这就完成了胰岛素调节下肝细胞内葡萄糖转化为糖原的过程[17，20-21]。本研究发现丁酸显著上调Akt 和GSK-3β的磷酸化水平，提示丁酸具有缓解胰岛素抵抗的作用，同时丁酸还可能通过Akt/GSK-3β 途径促进肝细胞糖原合成，具有降血糖作用。有文献报道，SCFA通过作用于内分泌细胞增加肠激素PYY 和胰岛素分泌而抑制胰高血糖素的分泌，进而增强肌肉和脂肪组织对葡萄糖的摄取[22]。此外SCFA 促进脂肪组织分泌瘦素，而瘦素可增加棕色脂肪组织和肌肉葡萄糖摄取，以及肝糖原合成，进而达到降血糖的作用[22-23]。以上研究表明SCFA 可通过促进或者抑制激素的分泌间接调节血糖，本研究结果提示，在肝脏中，SCFA 具有直接作用于肝细胞而调节血糖的潜能。

肝脏同时也是脂代谢的场所。肝脏可通过三羧酸循环将过量的碳水化合物转化为脂质，ACC 是AMPK 的下游靶分子，调节脂代谢[16]。其为脂质合成的限速酶，在AMPK 的调节下通过磷酸化和去磷酸化的作用影响脂代谢[24-25]。哺乳动物中ACC 分为ACC1 和ACC2 两种亚型，而受两种亚型调节所产生的丙二酰辅酶A 具有不同的生理作用，两者产生的丙二酰辅酶A 分别调节脂肪酸合成和脂肪酸氧化[26]。ACC 在未磷酸化时处于激活状态，激活AMPK可使两种ACC 同时磷酸化而失活，进而导致脂肪酸的合成受抑制，而脂肪酸的氧化水平增加，达到降低脂质水平的作用[25]。本研究发现乙酸、丙酸和丁酸磷酸化AMPK 和ACC1，提示SCFA 可能通过AMPK/ACC 途径抑制肝细胞脂肪酸合成，进而减少肝脏脂质积聚，缓解胰岛素抵抗。

综 上，SCFA 可 能 分 别 通 过Akt/GSK-3β 和AMPK/ACC 途径调节糖脂代谢，减少肝脏脂质积聚、降低血糖，进而预防和改善胰岛素抵抗。