组蛋白去乙酰化酶抑制剂Chidamide 抑制C2C12骨骼肌细胞分化及其机制

张露露，郭洋，王新莉，牛文彦

（1.天津医科大学基础医学院免疫学系，天津 300070；2.天津医科大学朱宪彝纪念医院消化内科，天津 300134）

骨骼肌是人体最大的组织，重量约占体重的40%，在调节机体的新陈代谢、运动、能量稳态等方面发挥着重要作用[1]。骨骼肌分化，即成肌，是一个多步骤过程，包括骨骼肌卫星细胞的激活、增殖、分化和多核肌纤维形成[2]。根据肌球蛋白重链（MyHC）的不同，骨骼肌主要分为四型多核肌纤维，即Ⅰ型肌原纤维（MyHC Ⅰ）、Ⅱa 型肌原纤维（MyHCⅡa）、Ⅱb 型肌原纤维（MyHC Ⅱb）和Ⅱx 型肌原纤维（MyHC ⅡIx）[3]。生肌调节因子4（MRF4）、生肌因子5（Myf5）、MyoD 和MyoG 是基本螺旋-环-螺旋转录因子家族成员，这些因子在胚胎发生和出生后肌发生期间调控骨骼肌细胞的决定和分化[4]。MyoD 和MyoG 的激活可促进MyHC 的表达，进而促进肌分化[5]。此外，MyoG 在调控肌纤维类型和氧化代谢中也发挥重要作用。

组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）是一类蛋白酶，在染色体结构修饰和基因表达调控中发挥重要作用。人类基因组有18 种不同的HDACs，分为4 类，Ⅰ类（HDAC1、2、3、8）、Ⅱ类（Ⅱa：HDAC4、5、7、9；Ⅱb：HDAC6、10）、Ⅲ类即沉默信息调节因子2 和Ⅳ类（HDAC11）。又根据对活性的要求将其分为锌依赖家族和辅因子NAD+依赖家族。其中Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅳ类HDACs 为锌依赖家族，被广泛研究[6]。临床研究显示小分子HDAC 抑制剂在治疗癫痫、躁郁症、癌症和许多其他疾病时会对骨细胞群产生影响。此外，越来越多的研究证实HDAC 在骨发育中发挥重要作用[7]。西达本胺（Chidamide）是一种新型苯甲酰胺类HDAC 抑制剂，在淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、软组织肉瘤[8]、肺癌[9]中显示出良好的治疗效果，但是Chidamide 对骨骼肌发育的影响尚不明确，本研究旨在探讨Chidamide 在体外对C2C12 骨骼肌细胞分化及肌纤维类型的影响和其潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 小鼠骨骼肌细胞株C2C12（购自美国ATCC），胎牛血清、马血清（以色列Bioind），DMEM 培养基（美国GIBO），二甲基亚砜（西格玛上海有限公司），西达苯胺（中国MCE 公司），Trizol 裂解液（美国Ambion 公司），逆转录试剂盒、实时荧光定量RT-PCR Mix（北京TransGen Biotech），罗氏实时荧光定量PCR 仪，Actinin1 抗体（美国Sigma），MyHC、MyoG（Santa 公司），Pan-acetyl H3 抗体（Active Motif 公司），Myh7、Myh4、Myh1（Proteintech 公司），Myh2（Affinity 公司），β-actin 抗体（中国Abclonal），DAPI、荧光二抗（天津博诚科技有限公司），耦联HRP 的山羊抗鼠抗体和山羊抗兔抗体（美国Jackson Immuno Research），增强化学发光底物检测的试剂盒（美国Millipore），Tannon-5200 显影仪（北京原平皓生物有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与药物处理 将C2C12 细胞接种于细胞培养板中，使用DMEM 高糖培养基（含10%胎牛血清）于37℃，5%CO2条件下培养，待细胞密度达80%时，换成DMEM 高糖培养基（含5%马血清）培养48 h，再分别与含有二甲基亚砜（DMSO）和西达苯胺（Chidamide）的分化培养基共培养48 h。

1.2.2 CCK-8 实验 培养瓶中细胞密度达到90%融合时消化细胞，吸取细胞进行稀释，并在计数板中计数，按照每孔接种5×103个细胞密度，接种于96孔板中，置于细胞培养箱中培养24 h，然后加入不同浓度（0、0.5、1、2、4 μmol/L）Chidamide 孵育，48 h 后每孔加入10 μL CCK-8 试剂，培养箱中孵育2 h，用酶标仪在450 nm 波长下检测吸光值。

1.2.3 细胞免疫荧光 将不同条件处理的C2C12细胞加入4%多聚甲醛固定，加入含0.1%Trixon 的PBS 打孔。用1%BSA 室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，第2 天，荧光二抗室温避光孵育30 min。DAPI避光染核，显微镜下拍照。

1.2.4 组蛋白提取 将各组细胞用含丁酸钠的冰PBS 冲洗两次，离心，弃上清，收集细胞。用TEB 溶解细胞，离心，弃上清。加入0.2 mol/L 的硫酸溶液溶解蛋白，过夜提取组蛋白，然后用TCA 溶液沉淀组蛋白。将溶液离心，弃上清，用丙酮溶液冲洗沉淀，离心，弃上清。沉淀干燥，加水溶解。

1.2.5 RNA的提取和实时荧光定量PCR 收集各组细胞，每孔加入500 μL Trizol 裂解细胞，然后收集到RNase free 管，加入100 μL 氯仿，混匀后室温静置5 min，然后12 000 r/min 4℃离心15 min，吸取上层透明RNA 到新的RNase free 管。加入异丙醇，混匀，静置10 min 后，离心，吸取管底的白色胶样RNA，用75%乙醇（DEPC 水配置）重复洗两遍后，加入20 μL 无酶水，金属浴助溶，58℃，2 min。然后测RNA 浓度。根据逆转录试剂盒的操作步骤合成cDNA 并稀释5 倍。以逆转录后的cDNA 为模板，按照实时荧光定量PCR 的说明书配置20 μL 反应体系并进行扩增。根据qPCR 得出的荧光曲线Ct 值，以GAPDH 基因为内参，用2-ΔΔCt计算结果。所用的引物序列见表1。

表1 扩增反应所需引物序列Tab 1 Primer sequences for amplification reaction

1.2.6 Western 印迹 收集各组细胞，用RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂）裂解细胞并提取总蛋白。制备10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，PVDF 转膜，转膜后，用5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，一抗（β-actin按1∶5 000 比例，Actinin1 按1∶5 000 比例，MyHC、MyoG 按1∶500 比例，Myh7、Myh4、Myh1 按1∶1 000比例，Myh2 按1∶2 000 比例，用1%BSA 稀释配置）4℃过夜孵育，次日，二抗室温孵育2 h，然后ECL 显色后曝光，Image J 进行定量分析。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism6 统计软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料均以表示，两组间均数比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Chidamide 对C2C12 细胞活力和组蛋白乙酰化 水平 的影响 CCK-8 检测不同浓度（0、0.5、1、2、4 μmol/L）Chidamide 对C2C12 细胞活力的影响（图1A），结果显示，不同浓度的Chidamide 不影响C2C12 细胞活力（F=0.058，P＞0.05），选用4 μmol/L Chidamide 作为后续实验浓度。Western 印迹结果显示，Chidamide 显著升高Pan-acetyl H3 蛋白水平 （t=3.22，P＜0.05）（图1B）。

图1 Chidamide 对细胞活力和Pan-acetyl H3 水平的影响Fig 1 Effects of Chidamide on cell viability and Pan-acetyl H3 levels

2.2 Chidamide 对C2C12 细胞分化的影响 结果显示，与对照组相比，Chidamide 组MyHC 阳性的肌纤维明显减少，肌细胞融合受损，融合指数降低，推测Chidamide 可能抑制C2C12 细胞的分化（图2A）。进一步检测MyHC 的蛋白和mRNA 的表达，发现与对照组相比，Chidamide 组MyHC 的mRNA 水平显著降低（t=26.87，P＜0.01），MyHC 蛋白水平也显著降低（t=5.71，P＜0.01，图2B、2C）。

图2 Chidamide 对MyHC 表达的影响Fig 2 Effect of Chidamide on MyHC expression

2.3 Chidamide 对C2C12 细胞分化相关蛋白的影响 与对照组相比，Chidamide 组MyoD 和MyoG 的mRNA 水平显著降低（t=5.81、4.86，均P＜0.01），蛋白水平也显著降低（t=6.05、7.37，均P＜0.01），见图3。

图3 Chidamide 对MyoD 和MyoG 的影响Fig 3 Effect of Chidamide on MyoD and MyoG expression

2.4 Chidamide 对Ⅰ型肌原纤维的影响 与对照组相比，Chidamide 组Myh7 的mRNA 水平显著降低（t=4.85，P＜0.01），其蛋白水平也显著降低（t=3.93，P＜0.01），见图4。

图4 Chidamide 对Myh7 的影响Fig 4 Effect of Chidamide on Myh7 expression

2.5 Chidamide 对Ⅱ型肌原纤维的影响 与对照组相比，Chidamide 组Myh1 和Myh2 的mRNA 水平显著降低（t=15.48、16.82，均P＜0.001，图5A），蛋白水平也显著降低（t=14.13、5.05，均P＜0.01，图5B），但Chidamide 不影响Myh4 的mRNA 水平（t=1.50，P＞0.05，图5C）和蛋白水平（t=2.19，P＞0.05，图5D）。

图5 Chidamide 对Myh1、Myh2 和Myh4 的影响Fig 5 Effect of Chidamide on the expression of Myh1,Myh2 and Myh4

3 讨论

在表观遗传机制中，组蛋白去乙酰化已被证明影响肌肉再生[10]。有文献报道，HDAC1 通过叉头盒蛋白3a（FoxO3a）诱导肌肉萎缩[11]；HDAC3 调节骨骼肌能量代谢[12]；敲降HDAC4 通过抑制MyoG 依赖性萎缩基因激活来缓解去神经诱导的肌肉萎缩[13]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275 通过下调破骨细胞生成转录因子（c-Fos）表达，防止破骨细胞生成并抑制小鼠骨质流失。组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸通过抑制癌症恶病质中CCAAT/增强子结合蛋白β（C/EBPβ）调节的萎缩基因1（Atrogin1）表达，减轻骨骼肌萎缩[14]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A 通过凋亡信号调节激酶1（ASK1）-丝裂原活化蛋白激酶3/4/6（MKK3/4/6）-c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）途径在分化的C2C12 肌细胞中转录激活肌肉生长抑制素（MSTN）[15]。

Chidamide 是Ⅰ类（HDAC1、2、3） 和Ⅱb 类（HDAC10）HDAC 抑制剂，对骨骼肌细胞分化的影响未见报道。本研究检测了不同浓度Chidamide 对细胞活力的影响，发现Chidamide 不影响细胞活力并且使组蛋白乙酰化水平升高。通过细胞免疫荧光MyHC 染色，发现Chidamide 使MyHC 阳性肌纤维的比例降低，使肌细胞融合受损，推测Chidamide 可能抑制C2C12 细胞分化。接下来笔者进一步检测了MyHC 的mRNA 和蛋白水平，发现Chidamide 处理后显著降低MyHC 的表达，结果与其免疫荧光染色结果一致，说明Chidamide 抑制C2C12 细胞分化。

肌源性分化是骨骼肌发育的一个重要过程，它决定了成肌细胞命运、肌肉形成和再生。肌源性调节因子Myf5、MyoD、MyoG、MRF4 调控骨骼肌细胞增殖、分化和融合[16]。MyoD 在肌分化早期表达，结合下游靶基因启动子中的E-box 序列，从而与肌细胞增强因子2（Mef2）转录因子协同驱动肌肉相关基因的转录，进而促进肌分化；MyoG 表达较晚，是骨骼肌分化所必需的因子，通过促进成肌细胞融合和肌纤维形成来促进分化。根据文献报道，C2C12 细胞中MyoG 的转录激活会增强肌分化[17]；HDAC11 通过抑制MyoD 依赖性转录来抑制成肌细胞分化[18]。因此，笔者检测了MyoD、MyoG 的mRNA 和蛋白水平，发现Chidamide 显著下调MyoD 和MyoG 的表达，鉴于MyoD 和MyoG 在C2C12 细胞分化中发挥正调控作用，提示Chidamide 可能通过下调MyoD 和MyoG的表达抑制C2C12 细胞分化。

根据收缩特性，哺乳动物肌纤维分为慢氧化型（MyHC Ⅰ型）、快氧化型（MyHC Ⅱa 型）、中间型（MyHC Ⅱx 型）和快速糖酵解型（MyHC Ⅱb 型）肌纤维。与糖酵解或中间型肌纤维相比，氧化型肌纤维富含线粒体和毛细血管，抗疲劳能力更强，更依赖氧化磷酸化产生能量。骨骼肌纤维类型转化与人体肌肉和代谢性疾病有直接关系。肌肉废用，如脊髓损伤，导致Ⅰ型纤维萎缩，纤维类型从慢到快转变，而癌症恶病质导致Ⅱ型纤维优先萎缩，纤维类型从快到慢转变[19]。因此，本研究进一步检测Chidamide 处理C2C12 细胞后对肌原纤维的影响。结果显示，与对照组相比，Chidamide 显著降低Myh7、Myh1 和Myh2 的表达，但不影响Myh4 的表达。表明Chidamide 抑制Ⅰ型、Ⅱx 型、Ⅱa 型肌原纤维，不影响Ⅱb 型肌原纤维，提示Chidamide 对各型肌纤维类型有不同的影响。

综上所述，本研究证明Chidamide 抑制C2C12骨骼肌细胞分化，且主要抑制Ⅰ型、Ⅱa 型、Ⅱx 型肌原纤维，但不影响Ⅱb 型肌原纤维，其机制可能与Chidamide 下调MyoD 和MyoG 的表达有关。