LATS2 对恶性周围神经鞘瘤细胞的调控作用及分子机制探讨

赵洋，孙亚敏，朱香熹，陈毓锴，朱泽

（1.天津医科大学基础医学院病原生物学系，天津 300070；2.遵义医科大学珠海校区临床医学系，珠海 519090；3.天津医科大学南开临床学院，天津 300102）

恶性周围神经鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST）是一种侵袭性的高度恶性软组织肉瘤，起源于施万细胞或施万前体细胞[1]，约占软组织肉瘤的5%～10%，易早期转移，由于对放化疗有耐药性而预后较差、死亡率较高。近年来，随着对表观遗传学的深入了解，越来越多的研究关注于推动癌症进展的表观遗传机制。多梳抑制复合物2（polycomb repressive complex，PRC2）核心组分由Zeste12 抑制因子（suppressor of zeste 12，SUZ12）、Zeste 基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）和负责变构激活的胚胎外胚层发育基因（embryonic ectoderm development，EED）组成，作为重要的表观遗传修饰酶，已被证明在MPNST中存在多组分的缺失，不能催化组蛋白3 第27 位赖氨酸上的三甲基化（trimethylation of lysine 27 on histone3，H3K27me3）形成，解除对基因沉默的维持作用，驱动良性前体肿瘤恶性转化为MPNST[2]。本课题组前期研究也显示，SUZ12 和H3K27me3 在42 例国内MPNST 临床组织样本也存在缺失现象，并明确了SUZ12 缺失的意义[3]。

在HIPPO 信号通路的经典途径中大肿瘤抑制激酶1/2（large tumor suppressor kinase 1/2，LATS1/2）磷酸化下游效应因子Yes 相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）和含有PDZ 结合位点的转录共激活因子（transcription coactivator with PDZ-binding motif，TAZ），使其发生胞浆滞留，不能入核执行转录激活作用，从而调控组织器官的体积及大小[4]。一项研究采用免疫组化的方法在45 例MPNST 组织标本中验证了YAP 和TAZ 的核表达阳性率，分别是58%和72%[5]，表明YAP 和TAZ 在MPNST 中呈过度激活状态，然而，HIPPO 通路中很少发生突变，其信号的失调很可能是由于上游基因的表观遗传改变等异常引起[6]。相关研究报道显示，在Schwann 细胞中敲除LATS1/2 会导致YAP/TAZ 的过度激活，并形成MPNST 样肿瘤[7]。此外，研究发现LATS2在Hela-S3 细胞中正向调控PRC2 组分的蛋白和转录水平，以维持H3K27me3 的完整性[8]，表明LATS2在维持表观遗传完整性方面具有一定的作用。因此，课题组前期对MPNST 细胞系进行了RNA-seq，发现LATS2 存在缺失现象，为验证其缺失是否参与调控MPNST 恶性进展，本研究通过在MPNST 细胞系中过表达LATS2 探讨其对PRC2 组分的表达是否存在调控作用，并探索LATS2 对MPNST 细胞系增殖、迁移的影响及机制，为临床治疗提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 STS26T、ST88-14 细胞株由天津医科大学肿瘤医院杨吉龙教授馈赠；过表达慢病毒购 自 上 海 吉 凯 公 司；LATS2、YAP、TAZ、SUZ12、EZH2、EED 引物由浙江金唯智公司合成；CCK-8 试剂盒购自新赛美公司；TAZ 抗体购自Proteintech 公司；p-TAZ 抗 体 购 自CST 公 司；LATS2、YAP、p-YAP、SUZ12、EZH2、EED、H3K27me3 抗体购自Abcam 公司；BIRC5、CTGF 抗体购自Wanleibio 公司；荧光定量PCR 仪购自Applied Biosyst 公司；电泳仪和凝胶成像分析仪购自BIORAD 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人MPNST 细胞系STS26T、ST88-14 采用含10% 胎牛血清和1% 青/链霉素的DMEM完全培养基，于37℃、7.5%CO2孵箱培养。

1.2.2 慢病毒感染人MPNST 细胞系STS26T、ST88-14 实验分为阴性对照（LV-VETOR）组、过表达LATS2（LV-LATS2）组。对数生长期的细胞接种于6孔板，保证第2 天细胞密度为20%～30%。根据细胞最适MOI（MOI=50）及细胞数、病毒滴度计算需加入病毒量。病毒于冰上融化，细胞换液并预留加入病毒液体积，分别加入病毒及感染增强液。37℃培养16 h 后更换为正常培养基，继续培养至72 h后荧光显微镜观察感染效率，细胞绿色荧光率＞80%用于后续实验。

1.2.3 CCK-8 实验 感染后处于对数生长期的细胞消化并计数，调整为细胞密度3×104个/mL 的细胞悬液，取100 μL 细胞悬液接种于4 块96 孔板，设3 个复孔。分别培养24、48、72、96 h，弃液并加入110 μL 含10 μL CCK-8 试剂的无血清培养基。37℃孵育2 h 后使用酶标仪测定450 nm 处吸光度值。

1.2.4 划痕实验 6孔板底部划线，每孔均匀穿过5 条直线，观察点为直线与划痕的交叉点。感染后处于对数生长期的细胞消化并计数，每组取7×105个细胞接种于6 孔板，过夜培养。用200 μL 枪头垂直底部横线竖向划痕，PBS 清洗3 次后加入含1%FBS 的DMEM 培养基，继续培养。观察并拍照记录0、48 h 细胞迁移情况。

1.2.5 免疫印迹实验 慢病毒感染细胞至72 h 时，加入RIPA 裂解液提取总蛋白，取上清进行BCA 蛋白定量测定蛋白浓度，金属浴中加热10 min，保存于-20℃。蛋白上样量20 μg，经SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转膜条件为300 mA 恒流，80 min，封闭2 h。一抗：LATS2（1∶1 000）、YAP（1∶1 000）、p-YAP（1∶1 000）、TAZ（1∶1 000）、p-TAZ（1 ∶1 000）、BIRC5（1 ∶500）、CTGF（1 ∶500）、SUZ12（1∶1 000）、EZH2（1∶1 000）、EED（1∶1 000）、H3K27me3（1∶1 000）、GAPDH（1∶3 000）、β-actin（1∶3 000）。4℃孵育过夜，室温二抗孵育1 h，显影并曝光。

1.2.6 实时荧光定量RT-PCR 慢病毒感染细胞至48 h 时，用Trizol 裂解法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA 浓度，并逆转为cDNA，以此为模板进行荧光定量RT-PCR 检测。引物序列表1。

表1 LATS2、YAP1、TAZ、BIRC5、CTGF、SUZ12、EZH2、EED 引物序列Tab 1 Primer sequences of LATS2，YAP1，TAZ，BIRC5，CTGF，SUZ12，EZH2 and EED

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0 和Image J 软件进行数据分析和作图。数据符合正态分布，采用t 检验进行差异分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒介导的LATS2过表达效果检测 慢病毒感染人MPNST 细胞系ST88-14、STS26T 72 h 荧光感染效率（图1A）；实时荧光定量RT-PCR 结果显示，与LV-VETOR 组相比，LV-LATS2 组ST88-14、STS26T 细胞LATS2 mRNA 表达水平明显升高（t=9.516、16.75，均P＜0.001，图1B）；Western 印迹结果显示，与LV-VETOR 组相比，LV-LATS2 组ST88-14、STS26T 细胞LATS2 蛋白表达水平明显升高（t=13.58、10.86，均P＜0.001，图1C）。

图1 慢病毒介导的LATS2 过表达效果检测Fig 1 Detection of the effect of lentiviral-mediated LATS2 overexpression

2.2 过表达LATS2显著抑制人MPNST细胞系的 增殖能力CCK-8实验结果显示，与LV-VETOR组相比，LV-LATS2 组ST88-14、STS26T 细胞48、72、96 h OD 值均显著降 低（t=4.219、14.66、11.5，均P＜0.05；t=5.674、7.118、10.77，均P＜0.01）（图2）。

图2 过表达LATS2 对人MPNST 细胞系增殖的影响Fig 2 Effect of LATS2 overexpression on the proliferative of human MPNST cell lines

2.3 过表达LATS2 显著抑制人MPNST细胞系的迁移能力 划痕实验结果显示，与LV-VETOR 组相比，LV-LATS2 组ST88-14 细胞迁移率降低23.6%（t=4.838，P＜0.01），STS26T 细胞迁移率降低12.5 %（t=4.736，P＜0.01）（图3）。

图3 过表达LATS2 对人MPNST 细胞系迁移的影响Fig 3 Effect of LATS2 overexpression on the migration of human MPNST cell lines

2.4 过表达LATS2 升高YAP/TAZ 蛋白的磷酸化水平，从而影响下游基因表达 实时荧光定量RT-PCR结果显示，与LV-VETOR 组相比，LV-LATS2 组ST88-14 细胞、STS26T 细胞的YAP、TAZ mRNA 表达水平差异均无显著统计学意义（t=0.655 2、2.266，均P＞0.05；t=1.500、2.489，均P＞0.05），BIRC5、CTGF mRNA 表达水平均显著降低（t=10.65、7.349，均P＜0.01；t=14.73、15.11，均P＜0.0 01）（图4A）；Western 印迹结果显示，与LV-VETOR 组相比，LVLATS2 组ST88-14 细胞、STS26T 细胞YAP、TAZ 总蛋白表达水平均无显著统计学差异（t=0.778 2、0.020 1，均P＞0.05；t=0.018 18、1.030，均P＞0.05），磷酸化水平均显著升高（t=6.233、3.759，均P＜0.01；t=3.440、2.947，均P＜0.05），BIRC5、CTGF 蛋白表达水平均显著降低（t=5.134、5.138，均P＜0.01；t=5.676、8.205，均P＜0.01）（图4B）。

图4 过表达LATS2 对人MPNST 细胞系YAP/TAZ 磷酸化水平的影响Fig 4 Effect of LATS2 overexpression on YAP/TAZ expression levels in human MPNST cell lines

2.5 过表达LATS2 对PRC2 核心组分转录及蛋白水平无显著影响但升高H3K27me3 蛋白水平 实时荧光定量RT-PCR 结果显示，与LV-VETOR 组相比，LV-LATS2 组ST88-14、STS26T 细胞中SUZ12、EZH2、EED mRNA 表达水平均无显著统计学差异（t=1.465、2.149、1.202，均P＞0.05；t=0.328 8、0.875 8、1.982，均P＞0.05）（图5A）；Western 印迹结果显示，与LV-VETOR 组 相 比，LV-LATS2 组ST88-14、STS26T 细胞SUZ12、EZH2、EED 蛋白表达水平均无显著统计学差异（t=1.262、1.196、0.3120，均P＞0.05；t=0.264 3、0.340 3、0.579 7，均P ＞0.05），H3K27me3表达水平明显升高（t=6.569、16.68，均P＜0.01）（图5B）。

图5 过表达LATS2 对人MPNST 细胞系PRC2 组分表达水平的影响Fig 5 Effect of LATS2 overexpression on the expression level of PRC2 components in human MPNST cell lines

3 讨论

MPNST 由于其基因层面的异质性，诊断治疗方法的局限性以及高度侵袭性，使其在临床上一直属于难治性肿瘤，可分为NF1 相关型、散发型及放化疗相关型，分别占50%、40%、10%，其中NF1 相关型MPNST 被证明预后最差[9]。Ⅰ型神经纤维瘤病（neurofibromatosis type 1，NF-1）是一种常染色体显性遗传病，发病率为1/3 000，由NF1 基因缺失突变引起，患者发展为MPNST 的风险是普通人群的1 000 倍[10]。大量研究表明，NF1 基因的缺失仅引起良性病变，恶性转化的发生依赖于额外的遗传变异，尤其是表观遗传机制的异常，包括PRC2 核心组分缺失引起的H3K27me3 表达水平异常[11]。目前临床上仍然缺乏有效治疗药物，严峻的现实急需对促进MPNST 发生、发展的机制进行新的探索，以寻找新的治疗靶点。

LATS2 定位于染色体13q11-12，编码Ser/Thr激酶，参与多种生物学过程，包括细胞周期G1/S 转换[12]、有丝分裂[13]、DNA 损伤[14]等。LATS2 在肿瘤恶性进展中的作用和机制十分复杂，其通过HIPPO 经典途径MST1/2-LATS21/2-YAP/TAZ 轴抑制肿瘤进展的相关研究已被大量文献报道，如Guo 等[15]，Shi等[16]的研究指出LATS2 在胶质瘤中通过灭活YAP抑制胶质瘤细胞的恶性行为。另外，LATS2 可通过直接抑制MDM2 的活性促进P53 的稳定性[17]，且通过P53 依赖性机制下调Bcl 家族的抗凋亡蛋白发挥诱导凋亡的作用[18]，从而抑制肿瘤发生、发展。最近，有研究发现在Hela-S3 细胞中LATS2 可与染色质上的PRC2 结合并使其磷酸化，影响PRC2 的HMTase能力，以激酶依赖的方式调控H3K27me3 表达，同时可正向调控PRC2 组分的蛋白及转录水平[4]。本课题组前期研究显示，在42 例国内MPNST 临床组织样本中存在SUZ12 和H3K27me3 缺失现象[3]，因此，提出LATS2 参与调控MPNST 表观遗传机制的假设。

课题组前期对MPNST 细胞系ST88-14 及STS26T 进行了RNA-seq，发现LATS2 均存在缺失现象，因此本研究旨在阐明LATS2 对MPNST 细胞系H3K27me3 表达的影响，探讨其与PRC2 核心组分之间的相互作用关系，验证LATS2 对细胞增殖、迁移的影响及机制。研究结果显示，过表达LATS2 一定程度上抑制MPNST 细胞系的增殖和迁移。数据显示，ST88-14 和STS26T 细胞中过表达LATS2 明显提高YAP/TAZ 的蛋白磷酸化水平，并降低下游效应因子BIRC5、CTGF 的表达，这一发现证实了LATS2 在MPNST 中通过调控YAP/TAZ 的磷酸化水平发挥抑癌作用。而且，过表达LATS2 明显提高H3K27me3 蛋白水平，表明在MPNST 细胞系中LATS2 具有参与协调表观基因组的作用。Wu 等[7]报道，在Schwann 细胞系中敲除HIPPO 通路的LATS1和LATS2 会产生组织学上与MPNST 相似的肿瘤。Inoue 等[19]建立了LATS 驱动的GEM-MPNST 模型和NF1/P53 驱动的GEM-MPNST 模型，并进行了转录本的比较，发现两种肿瘤均缺乏LATS1/2 蛋白，并且含有高水平的TAZ 蛋白，且均显示出不同程度的H3K27me3 丢失，这与笔者的结果相一致。值得注意的是，过表达LATS2 并未对PRC2 核心组分SUZ12、EZH2、EED 的mRNA 和蛋白水平产生影响。据报道，在爆发性肝功能衰竭中lncRNA NEAT1可向LATS2 启动子区招募EZH2，EZH2 通过促进H3K27me3 形成抑制LATS2 的表达[20]，而且在MPNST 中EZH2 已被证明未发生突变，相比于SUZ12、EED 缺失现象，一些MPNST 中表现出EZH2 的过度表达[21]，这可能解释了过表达LATS2 后ST88-14及STS26T 中H3K27me3 升高的现象，并提示EZH2在MPNST 发病机制中的潜在作用，这一假设还需进一步实验验证。另外，一项研究采用CRISPR Cas9技术在人类永生化Schwann 细胞模型和人类MPNST 细胞系中，分别诱导103 个肿瘤抑制基因（TSG）和癌基因候选基因的功能缺失突变，其中TAOK1、GDI2、NF1 和APC 基因中的功能缺失突变导致永生化人Schwann 雪旺细胞的转化和异种移植模型中的肿瘤形成，且导致HIPPO/YAP 信号的激活，这可能是MPNST 中YAP/TAZ 过度激活的又一诱因，有望为揭示MPNST 发病机制开启新的方向[22]。

综上所述，本研究证实了LATS2 过表达后可升高H3K27me3 表达水平，并通过改变YAP/TAZ 的磷酸化水平，降低下游基因BIRC5、CTGF 表达，从两个方面调控MPNST 细胞系的增殖和迁移，阐明了LATS2 在MPNST 细胞系中参与调控表观遗传，其低表达是促MPNST 恶性进展的重要因素，有助于为临床抗肿瘤治疗提供新的靶点和理论参考。