柿叶黄酮的镇痛抗炎作用及对口腔溃疡大鼠p38MAPK和MMP2/9的调控作用

王 朔 赵作勤 张古泉 张永丽

山东第一医科大学（山东省医学科学院）口腔医学院，山东 泰安 271016

口腔溃疡，俗称“口疮”，多见于舌腹、软腭、内唇等部位，临床上以复发性口腔溃疡最为常见。口腔溃疡的发病原因复杂，目前多认为与口腔菌群紊乱、微量元素缺乏等多种因素有关，但确切病因和发病机制至今尚不明确［1］。研究发现，炎症和氧化应激始终贯穿于口腔溃疡的发生、发展和自愈过程中［2-3］。

口腔溃疡的病因病机不明确，目前尚无治疗口腔溃疡的特效药物。柿叶黄酮（persimmon leaf flavonoids，PLF）是柿叶中的主要有效成分，主要包括槲皮素、芦丁、山奈酚等。研究表明，PLF具有抗菌、抗氧化、抗炎以及保护心脑血管系统等药理活性［4］。本团队前期研究发现，PLF具有良好的抗口腔溃疡作用，其机制与其抗炎抗氧化作用有关［5-6］。疼痛是口腔溃疡的主要症状，严重影响患者的生活和工作［7］。PLF能否通过缓解疼痛发挥对口腔溃疡的防治作用，相关研究较少，此外，PLF的抗炎机制需进一步深入研究。基于此，本研究通过小鼠扭体实验、痛阈测定实验、耳廓肿胀实验、足趾肿胀实验等方法考察PLF的镇痛作用和抗炎作用；并建立口腔溃疡大鼠模型，探索PLF对口腔溃疡组织中p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、基质金属蛋白酶-2/9（matrix metalloproteinase-2/9，MMP-2/9）蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18 ～ 22 g；SD大鼠，雌雄各半，体质量200 ～ 240 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK（京）2012-0001。动物置于12 h昼夜交替，室温20 ～25 ℃，湿度为40% ～ 60%环境中，普通饲料喂养，自由饮水。

1.2 主要试剂和药品

PLF由陕西慈缘生物技术有限公司提供；阿司匹林（acetylsalicylic acid， ASA）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，A104180）；桂林西瓜霜（watermelon frost， WF）（桂林三金药业股份有限公司，国药准字Z45021599）；p38MAPK、p-p38MAPK、MMP-2、MMP-9一抗（Abcam，ab218177、ab221013、ab92536、ab76003）。

1.3 主要仪器

Von Frey Hairs纤毛机械刺激针（美国North Coast公司）；YLS-7B足趾容积测量仪（济南益延科技发展有限公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）；AI600自动化学发光凝胶成像分析仪（德国Eppendorf公司）；BSA224S电子分析天平（德国Sartorius公司）；小动物麻醉机（瑞沃德生命科技有限公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 PLF对小鼠的镇痛和抗炎作用 （1）分组与给药。取昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为5组，即生理盐水对照组，ASA 30 mg/kg组，PLF 25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg组，每组小鼠10只。每天灌胃1次，每只小鼠按0.01 mL/g给药。对照组给予生理盐水，给药组分别给予相应剂量的药物。连续给药7 d，末次给药30 min后进行实验。（2）扭体实验。每只小鼠腹腔注射0.6%新鲜配制的乙酸溶液0.2 mL，使其出现扭体反应，观察并记录在15 min内每只小鼠的扭体（小鼠的扭体表现为小鼠腹部的凹陷以及小鼠后肢的伸展）次数。（3）痛阈测定。将小鼠放入固定的容器中，待小鼠安静后，用刺激针刺激小鼠的后足，所选用的测试笔压力值由小到大逐渐递增，刺激小鼠右后脚掌使纤毛略呈S形且持续5 s，在小鼠出现抬足或舔足反应时，记录此时所使用触觉测试笔的压力值。（4）耳廓肿胀实验。将二甲苯20 μL均匀涂抹在小鼠右耳的正反两面，左耳不涂二甲苯。15 min后颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠双耳，对齐后用打孔器（直径6 mm）打孔，用精密分析天平称重左右耳，计算肿胀率：肿胀率（%）=（右耳片重-左耳片重）/左耳片重 × 100%。（5）足趾肿胀实验。将小鼠双足踝关节进行统一标记。末次给药30 min后，于小鼠的左右后足处由掌心向踝关节方向进针，皮下注射10%蛋清0.04 mL，用足趾容积测定仪分别测定致炎后0 min、5 min、30 min、60 min时小鼠后足的足趾容积，计算足趾的肿胀度：肿胀度（%）=［双足容积（注射后）-双足容积（注射前）］/双足容积（注射前） × 100%。

1.4.2 PLF对口腔溃疡大鼠的防治作用 （1）大鼠口腔溃疡（醋酸法）模型的建立。参考文献［7］，以戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，将50%冰醋酸滤纸片（3 mm × 3 mm）置于下切牙唇侧穹窿区30 s，移除滤纸片后观察受损区变化。空白对照组不做处理。模型大鼠在冰醋酸处理后24 h均出现明显溃疡面，肉眼观察溃疡面的黏膜呈凹陷性损伤，表面苍白色，周围充血水肿明显，口腔溃疡模型制备成功。（2）分组和给药。SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、WF（200 mg/kg）组、PLF（20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg）组，每组10只。各给药组灌胃给予相应剂量的药物，空白对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水。于造模后第2天开始给药，连续给药7 d。（3）免疫印迹。留取的溃疡和正常组织加入RIPA裂解液裂解匀浆，离心取上清，提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。凝胶电泳分离蛋白，转PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗（1∶1 000）4 ℃反应过夜，次日用TBST清洗后，滴加二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，再用TBST清洗后，ECL显色，以β-actin为内参，凝胶成像仪检测，计算目的蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析。计量资料符合正态分布采用表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD（最小显著差异法）检验。检验水准α= 0.05。

2 结 果

2.1 PLF对小鼠镇痛作用的影响

2.1.1 PLF对冰乙酸致小鼠扭体反应的影响 与生理盐水组相比较，ASA组和PLF组（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg），小鼠扭体反应次数明显减少，差异有统计学意义（P ＜0.001），见表1。

表1 PLF对冰乙酸所致小鼠扭体反应的影响（）

表1 PLF对冰乙酸所致小鼠扭体反应的影响（）

注：PLF为柿叶黄酮；ASA为阿司匹林。与生理盐水组相比，aP ＜ 0.05。

n组别生理盐水组ASA（30 mg/kg）组PLF（25 mg/kg）组PLF（50 mg/kg）组PLF（100 mg/kg）组10 10 10 10 10小鼠扭体次数/（次/min）5.333 ± 2.733 2.167 ± 1.169a 1.833 ± 0.408a 1.500 ± 0.548a 1.000a F P 15.341＜ 0.001

2.1.2 PLF对小鼠痛阈的影响 与生理盐水组相比，ASA 30mg/kg组和 PLF（20 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）组小鼠的疼痛阈值明显增加，差异有统计学意义（P ＜0.001），见表2。

表2 PLF对小鼠痛阈值的影响（）

表2 PLF对小鼠痛阈值的影响（）

注：PLF为柿叶黄酮；ASA为阿司匹林。与生理盐水组相比，aP ＜ 0.05。

组别生理盐水组ASA（30 mg/kg）组PLF（25 mg/kg）组PLF（50 mg/kg）组PLF（100 mg/kg）组n 10 10 10 10 10压力值/g 1.500 ± 0.2449 4.333 ± 1.506a 4.000a 4.000a 6.000a F P 154.615＜ 0.001

2.2 PLF对小鼠抗炎作用的影响

2.2.1 PLF对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响与生理盐水组相比，ASA 30 mg/kg组和PLF 50 mg/kg组二甲苯所致小鼠耳廓炎症肿胀明显减轻，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表3。

表3 PLF对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀度的影响（）

表3 PLF对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀度的影响（）

注：PLF为柿叶黄酮；ASA为阿司匹林。与生理盐水组相比，aP ＜ 0.05。

n组别生理盐水组ASA（30 mg/kg）组PLF（25 mg/kg）组PLF（50 mg/kg）组PLF（100 mg/kg）组10 10 10 10 10耳廓肿胀率/%66.76 ± 25.68 45.16 ± 16.66a 68.41 ± 13.51 41.11 ± 11.64a 59.91 ± 19.93 F P 3.574 0.013

2.2.2 PLF对蛋清所致小鼠足趾肿胀的影响 如图1所示，肉眼下可见生理盐水组小鼠的足部色泽和形态正常；ASA 30 mg/kg组小鼠足掌和足趾呈明显的肿胀，而PLF 100 mg/kg组小鼠足部的肿胀度明显减轻。与生理盐水组相比，ASA 30 mg/kg组和PLF （25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）组均能抑制由蛋清所致的小鼠后足肿胀程度，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。详见表4。

图1 PLF对蛋清所致小鼠足趾肿胀度的影响

表4 PLF对蛋清所致小鼠足趾肿胀度的影响（）

表4 PLF对蛋清所致小鼠足趾肿胀度的影响（）

注：PLF为柿叶黄酮。与生理盐水组相比，aP ＜ 0.05。

组别生理盐水组ASA（30 mg/kg）组PLF（25 mg/kg）组PLF（50 mg/kg）组PLF（100 mg/kg）组足趾肿胀度/%60 min 4.7 ± 3.2 1.3 ± 1.0a 2.9 ± 1.8a 1.7 ± 2.3a 2.5 ± 1.8a 8.653＜ 0.001 n 10 10 10 10 10 F P 5 min 11.1 ± 4.9 8.9 ± 1.8 7.3 ± 3.1a 6.3 ± 2.1a 9.3 ± 2.3 5.891 0.002 30 min 8.6 ± 3.9 5.2 ± 2.8a 5.1 ± 2.8a 3.6 ± 2.0a 6.3 ± 2.6 6.503＜ 0.001

2.3 PLF对大鼠口腔溃疡组织中p38MAPK磷酸化水平和MMP-2/9的影响

与空白对照组相比，模型大鼠溃疡组织中MMP-2和MMP-9的蛋白水平显著升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；经PLF和WF干预后，MMP-2和MMP9的蛋白水平显著下降，且呈剂量依赖性（图2A和B）。与空白对照组相比，模型大鼠溃疡组织中p38MAPK和p-p38MAPK蛋白水平显著升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；WF和PLF对p38MAPK蛋白水平无影响，但可显著降低pp38MAPK的蛋白水平，表明WF和PLF可抑制p38MAPK磷酸化水平（图2C，D和E）。

图2 PLF对大鼠口腔溃疡组织中p38MAPK磷酸化水平和MMP2/9表达量的影响

3 讨 论

口腔溃疡导致的局部剧烈疼痛可严重影响患者的工作和生活［8］。目前，对口腔溃疡患者的治疗原则是减少复发次数、减轻疼痛和促进愈合［9］。口腔溃疡的局部治疗常用麻醉剂（如利多卡因），但这些麻醉药品会对受损黏膜组织造成刺激［10］，不利于损伤组织愈合。炎症在口腔黏膜组织损伤中具有至关重要的作用。炎症细胞的浸润对口腔黏膜细胞的损伤、炎症介质（如基质金属蛋白酶）对组织细胞外基质中的胶原降解、氧自由基导致的组织损伤等机制促使溃疡的发生，因此抗炎抗氧化可有助于促进组织修复及治疗口腔溃疡［11-2］。本团队前期研究发现，PLF可抑制口腔溃疡组织内的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）水平增高、抑制炎症细胞浸润、减轻氧化应激水平等，发挥显著的抗口腔溃疡作用［5-6］。

临床上常用西瓜霜喷剂、冰硼散等中成药进行口腔溃疡的治疗［13］。但这些中药对疼痛的影响有着明显不足，如冰硼散具有良好的清热解毒、消肿止疼作用，但冰片局部应用对感觉神经有刺激作用，口腔溃疡患者涂敷冰硼散时产生的疼痛患者常难以接受［14］。部分天然黄酮类化合物具有镇痛作用，如槲皮素、芦丁等可在脊髓水平调控炎性相关信号通路发挥镇痛作用［15］。PLF中的主要黄酮化合物为槲皮素、山奈酚等［16］。本研究通过PLF减轻醋酸诱导的小鼠扭体反应、提高小鼠的痛阈等方法证实其具有镇痛作用。本研究也从二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀实验、蛋清诱导的足趾肿胀实验证实PLF具有显著的抗炎作用，可以减轻炎症所致的血管通透性增加。上述结果表明，PLF具有改善炎症的“肿、痛”效果，可为PLF用于口腔溃疡的临床治疗提供良好的药理学基础。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路是细胞内信号转导的重要途经，包括细胞外信号调节激酶（extracellular-signal regulated protein kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK 3条途径，其中p38 MAPK信号途径主要参与调控炎症反应［17］。在外界刺激（活性氧、炎性反应介质等）下，p38 MAPK通路被激活，p38 MAPK磷酸化为p-p38 MAPK，由细胞浆转至细胞核，活化下游核转录因子，调节相关基因的表达，进而影响炎症反应、凋亡和细胞分化等［18］。MMP-2和MMP-9是一种明胶酶，可分解细胞外基质、抑制组织新生和伤口愈合过程［19］。研究发现，在口腔溃疡组织中MMP-2和MMP-9的表达明显增加，表明二者参与组织溃疡的形成过程；抑制MMP-2和MMP-9的表达，可发挥治疗口腔溃疡的作用［12，20］。张询等［21］研究发现，p38 MAPK信号通路可调控牙周膜细胞的MMP-2和MMP-9的表达。本研究发现，口腔溃疡组织内MMP-2和MMP-9的蛋白表达明显增加，给予PLF干预后，二者可被剂量依赖性的抑制。机体MMPs的活性可受转录水平调节、酶的活化、特异性组织抑制因子等因素调节［22］。本研究发现，在溃疡组织中酶proMMP-2的含量明显升高，PLF对其无明显影响，提示PLF不影响MMP-2转录水平的调节而是影响酶的活化。研究进一步发现，溃疡组织中p38 MAPK的蛋白表达水平明显增高，PLF不影响其表达；而p-p38 MAPK的结果显示，PLF可显著降低p38MAPK磷酸化水平。上述结果表明，PLF可抑制口腔溃疡中MMP-2和MMP-9的表达，可能与抑制p-38MAPK信号通路激活有关。

综上所述，本研究证实PLF具有镇痛抗炎作用，可为PLF开发成为治疗口腔溃疡药物提供药理学基础。PLF可下调口腔溃疡组织的中MMP-2和MMP-9的表达，其机制可能与抑制p38MAPK信号的激活有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突