基于网络药理学探讨蒙药翻白草治疗2型糖尿病的作用机制

杭宇昕 于佳琦 曹燕凤 徐 宁 刘景林 许 良

1. 内蒙古民族大学化学与材料学院，天然产物化学及功能分子合成内蒙古自治区重点实验室，内蒙古 通辽 028000；2. 北京中医药大学中药制药系，北京 102400

糖尿病是临床常见的内分泌代谢疾病，典型症状是多饮、多食、多尿、体质量减少，久病者常伴有各种并发症。糖尿病属我国古书记载的“消渴”领域，古代医者认为，消渴的病机多以阴虚燥热为主，中医经过多年的探究，在治疗糖尿病理论和实践中积攒了许多有效的科学经验［1-2］，近年来民族医药学也在治疗糖尿病及并发症方面取得了一定的成果［3-4］。蒙医称糖尿病为“希克尔西金”病，蒙医药治疗有其独特的优势，且毒副作用少，同时也在其发病机制及临床治疗等方面的科学研究取得了相对较高的进展［5］。

蒙药翻白草Potentilla discolor Bge.为蔷薇科植物，块根呈纺锤形或圆柱形，是我国的传统民族药材，在内蒙古地区广泛种植，又名“鸡腿儿、鸡腿根”等，始载于《救荒本草》，味甘、微苦，平，归肝、胃、大肠经。翻白草的功效有清热解毒、止痢、止血，用于湿热泻痢、痈肿疮毒、血热吐衄、便血［6］。后因翻白草具有优良的抗肿瘤以及降血糖等作用而广受关注，同时翻白草还具有疗效长、分布广、价格低廉等优点［7］。研究人员从蒙药翻白草中主要分离鉴定出萜类、黄酮类、甾体类、鞣质类和有机酸类等有效成分［8］。

网络药理学作为一门新兴学科，融合了“药物-成分-靶点”多层次的信息，与蒙医药整体观念一致，与蒙药多成分、多途径和多靶点协同作用的原理不谋而合，广泛地应用于蒙药潜在活性成分的预测及作用机制的阐述［9-10］。本研究借助网络药理学技术，通过筛选蒙药翻白草活性成分作用靶点和疾病靶点，建立“翻白草-翻白草活性成分-靶点”网络，探讨翻白草治疗2型糖尿病的作用机制，为传统蒙药寻找新的作用靶点提供理论依据，为其实验验证及药理研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 活性成分及靶点的筛选

在中药系统药理数据库分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中以“翻白草”为关键词进行检索，以类药性 ≥ 0.18、口服生物利用度 ≥ 30%作为筛选条件，从筛选结果中即可获得符合条件的翻白草活性成分，将活性成分输入数据库，检索获得对应的靶蛋白，通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）筛选人源的靶点基因和靶蛋白名称。

1.2 疾病候选靶点的筛选

在GeneCards数据库（http：//www.genecards.org/）中输入关键词“diabetes mellitus type 2” “type 2 diabetes mellitus”，得到2型糖尿病的相关基因，设定相关性分值（relevance score） ＞ 30，筛选符合条件的基因作为疾病候选靶点。

1.3 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络的构建

采过Venny软件获取翻白草活性成分靶点与2型糖尿病的基因靶点交集的基因，即潜在靶点，利用Cytoscape软件建立“翻白草-翻白草活性成分-靶点”网络图。将潜在靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/），选用Multiple proteins工具，以物种为“人”作为筛选条件，设置可信度为0.7，将网络显示设置为Hide disconnected nodes in the network，筛选过后的PPI网络图以TSV格式下载，通过Cytoscape软件对TSV格式的文件内容进行可视化展示，即可获得PPI网络图与关键核心靶点。

1.4 GO生物功能及KEGG通路富集分析

利用Metascape数据库进行自定义分析，选择物种参数为Homo sapiens，通过GO功能富集分析细胞组分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function， MF）、生物过程（biological process， BP），同时进行KEGG通路富集分析，对药物作用靶点或差异表达基因进行信号通路分析。

2 结 果

2.1 活性成分的获取

以1.1中的设置条件为筛选条件，在TCMSP数据库中得到相应翻白草活性成分的待选靶基因共176个，得到5种翻白草有效活性成分，如sitosterol、kaempferol、beta-sitosterol等（表1）。

表1 翻白草筛选后有效活性成分

2.2 作用靶点网络的构建

通过GeneCards数据库进行检索，与2型糖尿病的相关基因共13 947个，以relevance scores ＞ 30为限定条件，经筛选得到1 084个靶点基因，将以上结果作为本次实验的疾病候选基因，并将其与翻白草候选基因进行交集，得到目标潜在靶点104个（图1）。得到的翻白草活性成分及潜在的靶点基因，通过CytoScape软件进行可视化展示，网络的边、端点等属性设置见图2，得到翻白草-翻白草活性成分-靶点网络图。通过网络分析可以直观展示该网络含有182个节点，267条边，其中橙色图形代表有效活性成分，紫色图形代表翻白草，蓝色图形代表作用靶点（图2），可见翻白草治疗2型糖尿病具有多组分、多靶点的作用特点。

图2 翻白草-翻白草活性成分-靶点网络图

2.3 PPI网络的构建

PPI网络分析可以更有效地、直观地从系统的角度获取药物的靶蛋白基因，如图3所示。利用Cytoscape画图软件构建的PPI网络图由101个节点组成。将2.2中得到的104个靶点利用Excel表格整理后导入到STRING数据库中，结果保存为TSV格式的文件，并导入Cytoscape画图软件构建PPI网络图，图3和图4中的靶蛋白的节点大小随着degree值的增大而增大，颜色也随着节点变大而逐渐加深。表2中的13个核心靶点的筛选条件为degree值 ≥ 2倍的中位数。

图3 翻白草治疗2型糖尿病潜在靶点PPI网络图

表2 核心靶点degree值

2.4 GO生物功能及KEGG通路富集分析

利用Metascape数据库，选择物种参数为Homo sapiens进行自定义分析，可得到1 841个生物过程，得到的GO功能富集分析分为3个部分，CC、MF和BP结果取排名前10的富集结果进行可视化展示（图5）。结果表明，翻白草防治2型糖尿病BP主要通过调节无机物质的反应（response to inorganic substance）、细胞对化学应激的反应（cellular response to chemical stress）、对活性氧的反应（response toreactive oxygen species）等，CC主要包括膜筏（membrane raft）、膜微域（membrane microdomain）、质膜筏（plasma membrane raft）等，MF主要包括细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、受体配体活性（receptor ligand activity）等。

图5 翻白草治疗2型糖尿病GO功能富集分析

通过Metascape数据库对KEGG通路富集进行了分析与探究，结果共获得250条信号通路，利用Metascape在线工具对通路富集的结果进行了可视化展示，这些通路主要涉及癌症通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、脂质与动脉粥样硬化、乙型肝炎等通路，推断AGE-RAGE信号通路是翻白草活性成分参与发挥治疗2型糖尿病作用的主要调控途径（图6）。

图6 翻白草治疗2型糖尿病KEGG通路富集分析（前20条）

3 讨 论

翻白草的主要化学成分为黄酮类和萜类，例如槲皮素、山柰酚等，可以有效降低血糖。翻白草中的萜类成分可以显著地降低患病小鼠的血糖值，其中高剂量组和中剂量组改善血糖的作用更明显［11-12］。孙琛等［13-14］研究发现，翻白草中的黄酮类成分可改善高血糖小鼠的胰岛素抵抗。研究证实，黄酮类成分可以通过维护胰岛细胞和减缓胰岛素抵抗等多方面机制治疗2型糖尿病［15］。实验表明，翻白草总黄酮提取物和总三萜类提取物具有降糖作用，可能机制是较强的抗氧化活性和对细胞的保护作用［16］。由于检测的局限性，并非所有活性成分都能检测到，长期以来，蒙药翻白草治疗2型糖尿病的生物活性成分及其作用机制尚未完全解释清楚，需要从翻白草中鉴定具有明确、可重复和有效治疗或辅助治疗糖尿病效果的生物活性成分。

本文基于网络药理学探讨翻白草治疗2型糖尿病的作用机制，结果显示，翻白草治疗2型糖尿病的潜在活性成分有5种，潜在靶点104个，表明翻白草治疗2型糖尿病是多组分、多靶点共同作用的结果。通过对潜在靶点进行PPI网络分析，得到翻白草治疗2型糖尿病的主要活性成分有kaempferol、quercetin等。根据软件计算得出的degree值，筛选出了13个核心靶点，这些节点在PPI网络图中发挥着关键作用，为探索翻白草治疗2型糖尿病的核心靶点，得到显著性较大的靶点包括AKT1、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、TP53、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）等，AKT1在PPI中节点最大，可能是翻白草治疗2型糖尿病的重要靶点。AKT1参与调节许多过程，包括代谢、细胞存活，还影响细胞增殖和血管生成［17］。本研究中翻白草治疗2型糖尿病的靶点GO通路富集分析显示，翻白草治疗2型糖尿病BP主要通过调节无机物质的反应、细胞对化学应激的反应、对活性氧的反应等，CC主要包括膜筏、膜微域、质膜筏等，MF主要包括细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性等。KEGG信号通路富集分析显示，AGE-RAGE信号通路可能是翻白草活性成分参与发挥治疗2型糖尿病作用的主要调控途径。本文的数据挖掘为后续实验验证提供了一定的理论支持，后期拟此研究结果为基础，深入开展药效学评价、血清药物化学等研究。

蒙药翻白草具有多种药理活性，通过网络分析筛选其治疗2型糖尿病的有效成分及其蛋白质靶标，既能够进一步促成蒙药翻白草的开发和利用，还能为研发种类多样的蒙药提供新思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突