利格列汀二甲双胍缓释片的制备及其体内外评价

高慧雅 孔淑萌 孙 帅 陈 进 王梦君 孙考祥

1.烟台大学药学院，山东 烟台 264005； 2.中国科学院烟台药物研究所，山东 烟台 264000

近30年来，我国糖尿病患病率显著增加，特别是2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）发病人群逐渐年轻化［1］。目前市面上有多种联合用药方案，盐酸二甲双胍（metformin hydrochloride，MET）是治疗T2DM的一线首选和全程用药。研究表明，单用MET治疗较长时间后，容易发生多种不良反应［2］。利格列汀（linagliptin，LGLT）属于二肽基肽酶抑制剂，可作用于α、β细胞，双调控胰岛功能，能延长肠促胰素活性，促进胰岛素释放，并可抑制胰高血糖素分泌［3-4］。研究表明，LGLT治疗T2DM疗效确切，患者易耐受，安全性较好［5］。对于单一应用MET治疗效果不好的患者，可采用联合用药的方式进行治疗。LGLT与MET联合用药能将患者血糖及血脂控制在合适的水平，减少皮疹、过敏反应以及血管性水肿等不良反应的发生，确保患者用药安全，未来在临床中可广泛使用［6-7］。研究表明，在治疗T2DM时，LGLT与MET联合应用可以有效降低糖化血红蛋白数量以及降低空腹血糖，使尿白蛋白肌酐比有效降低，改善胰岛β细胞的分泌功能，改善氧化应激水平［8］，并对体质量无影响，是一种安全有效的治疗方法［9-11］。目前在国内LGLT与MET联用的制剂还未上市，因此，本研究主要以参比制剂为参考，研究制备与参比制剂质量一致的片剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 QUINTIX224-1CN型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；SECURA125-1CN型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；e2695型高效液相色谱仪（waters）；FE28型pH计（梅特勒）；加热磁力搅拌器（J&K SCIENTIFIC）；ZP10A型旋转压片机（北京新龙立科技有限公司）；CS101-2EBN型鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；YT-KHYQ型MD6万相混合机（深圳市信宜特科技有限公司）；1260型高效液相色谱仪器（安捷伦）；BGB-5F型高效包衣机（浙江小伦制药机械有限公司）。

1.1.2 试剂与药物 盐酸二甲双胍（宁夏恒康科技有限公司）；聚氧乙烯（polyoxyethylene，PEO）（上海卡乐康包衣技术有限公司）；利格列汀原料药（乳源东阳光药业有限公司）；L-精氨酸（上海协和氨基酸有限公司）；羟丙甲纤维素（hypromellose，HPMC）（安徽山河药用辅料股份有限公司）；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）（湖南尔康制药股份有限公司）；滑石粉（广西龙胜华美滑石开发有限公司）；欧巴代包衣粉（上海卡乐康包衣技术有限公司）；甲醇乙腈均为色谱纯（Sigma）；磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司）；磷酸二氢铵（国药集团化学试剂有限公司）；盐酸（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 测定波长的选择

将MET对照品溶液（浓度为5 μg/mL）和LGLT对照品溶液（浓度为5 μg/mL）按《中华人民共和国药典》2020版第四部通则0401紫外分光光度法，在200 ～ 400 nm波长范围内扫描，根据扫描结果可知，在233 nm处MET有吸收，故选择233 nm作为MET含量测定波长。在226 nm和294 nm处LGLT有吸收，故选择226 nm和294 nm作为LGLT含量测定波长。

1.2.2 标准曲线的建立

1.2.2.1 MET标准曲线的建立 精密称定MET 55 mg，置于50 mL容量瓶中，加pH 1.2盐酸溶液溶解定容，摇匀；取上述溶液10 mL，置于25 mL容量瓶中，加pH 1.2盐酸溶液定容，摇匀，制成含MET 0.44 g/L储备液。用pH 1.2盐酸溶液依次稀释得到浓度为22、44、88、132、176、220、264 μg/mL的溶液，分别精密量取上述溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量峰面积。以峰面积（y）为纵坐标，进样浓度（x）为横坐标，进行线性回归。结果表明，MET在22 ～ 264 μg/mL浓度范围内，线性关系良好，回归方程为y= 42.888x+ 58.836 （R² =0.999 6）。

1.2.2.2 LGLT标准曲线的建立 精密称取LGLT对照品28 mg置于10 mL量瓶中，加适量甲醇，超声溶解后，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密移取5 mL置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀释定容，摇匀，制成含LGLT 0.14 g/L储备液。用pH 1.2盐酸溶液依次稀释得到浓度为0.28、0.56、1.40、2.10、2.80、4.20、5.60、6.30、7.00 μg/mL的溶液，分别精密量取上述溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量峰面积。以峰面积（y）为纵坐标，进样浓度（x）为横坐标，进行线性回归。结果表明，LGLT在0.28 ～7.00 μg/mL浓度范围内，线性关系良好，回归方程为y= 45 918.644x－ 25.978（R2= 0.999 97）。

1.2.3 系统适用性实验

取MET对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.25 mg的溶液，作为MET系统适用性溶液。过滤并取续滤液液相测定，MET色谱峰理论塔板数不小于5 000， 系统适用性良好。

取LGLT对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.5 mg的溶液，精密量取适量，用稀释液定量稀释制成每1 mL中约含0.05 mg的溶液作为LGLT系统适用性溶液，过滤并取续滤液液相测定，理论塔板数不小于5 000，LGLT峰的拖尾因子在0.8 ～ 1.2范围内，系统适用性良好。

1.3 体外溶出度测定方法

参照美国食品和药物管理局（Food And Drug Administration，FDA）公布的利格列汀二甲双胍的溶出度测定方法和《中华人民共和国药典》2020版四部通则0931第二法［12］。

1.3.1 MET缓释片芯溶出度测定方法 取自制制剂，以pH 1.2盐酸溶液900 mL为溶出介质，转速为100 r/min，依法操作，分别在1、2、4、6、8、12 h取样6 mL，取样品1 mL置于5 mL容量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜，取续滤液过0.22 μm滤膜，取续滤液，作为供试品溶液，取20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。另取MET对照品适量，精密称定，加pH 1.2盐酸溶液溶解并定量稀释成每1 mL含MET 1.11 g/L的溶液，作为对照品溶液，取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算每片自制制剂在各时间点的累积溶出（%），以其平均值为纵坐标、时间（h）为横坐标绘制溶出曲线。

1.3.2 LGLT溶出度测定方法 取自制制剂，以pH 1.2盐酸溶液900 mL为溶出介质，转速为100 r/min，依法操作，分别在10、15、20、30、45 min取样6 mL，样品过0.22 μm滤膜，取续滤液20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。另取LGLT对照品适量，精密称定，加pH 1.2盐酸溶液溶解并定量稀释成每1 mL含LGLT 2.77 μg/mL的溶液，20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法以峰面积计算每片自制制剂在各时点的累积溶出（%），以其平均值为纵坐标、时间（min）为横坐标绘制溶出曲线。

1.4 体内药代动力学实验

选用6只比格犬（购自西安迪乐普生物医学有限公司）为实验动物，进行参比制剂（R）、自制制剂（T）的药代动力学实验。1、2、3号犬的给药序列为RT，4、5、6号犬的给药序列为TR。在各周期中，口服给予每只比格犬1片市售或自制利格列汀二甲双胍缓释片，喂水10 mL，确认吞咽无呕吐，记录给药时间。于给药前以及给药后的15 min、30 min、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h、12.0 h、24.0 h、32.0 h、48.0 h、72.0 h取血1 mL于肝素钠真空管中，4 000 r/min离心5 min，取上清于EP管中，置于-20 ℃冰箱冷冻待测。经30 d清洗期后，交叉给予自制或市售利格列汀二甲双胍缓释片，采样操作同上。

2 结 果

2.1 利格列汀二甲双胍缓释片的处方筛选

通过查阅文献以及参考参比制剂说明书，选择与参比制剂相同的辅料。MET片规格为1 g/片，LGLT片规格为5 mg/片。通过单因素考察，以片剂的体外溶出度为主要评价指标，确定利格列汀二甲双胍缓释片的最优处方。

2.1.1 MET缓释片芯的处方筛选

2.1.1.1 HPMC用量的考察 以HPMC为粘合剂、硬脂酸镁为润滑剂，选用PEO为缓释骨架材料，对片剂体外溶出效果进行考察，其他辅料用量不变，考察粘合剂HPMC用量对溶出效果的影响。结果表明，HPMC的用量越多，药物的溶出越慢。当粘合剂HPMC用量为每片100 mg时，与参比制剂较为相似，因此最终选择HPMC的用量为每片100 mg。详见图1。

图1 在pH 1.2的盐酸溶液溶出介质中，HPMC的用量对MET累积溶出度的影响

2.1.1.2 PEO的用量考察 以HPMC为粘合剂、硬脂酸镁为润滑剂，选用PEO为阻滞剂，其他辅料用量不变，考察不同用量PEO用量对体外溶出效果的影响。结果表明，PEO的用量越多，药物的溶出越慢。当PEO用量为每片600 mg时，与参比制剂较为相似，因此最终选择PEO的用量为每片600 mg。详见图2。

图2 在pH 1.2的盐酸溶液溶出介质中，PEO的用量对MET累积溶出度的影响

2.1.1.3 硬脂酸镁用量的考察 以HPMC为粘合剂、硬脂酸镁为润滑剂，选用PEO为阻滞剂，其他辅料用量不变，考察相同硬度条件下，不同用量硬脂酸镁对片重差异、溶出效果的影响。溶出结果表明，润滑剂硬脂酸镁的用量对片剂溶出效果的影响不大，因此最终选择润滑剂硬脂酸镁的用量为每片10 mg。详见图3。

图3 在pH 1.2的盐酸溶液溶出介质中，硬脂酸镁的用量对MET累积溶出度的影响

2.1.1.4 片剂硬度对溶出度影响的考察 以HPMC为粘合剂、硬脂酸镁为润滑剂，选用PEO为阻滞剂，考察不同片剂硬度对溶出效果的影响。溶出结果表明，硬度越大，药物溶出越慢，自制制剂硬度在170 N的时候溶出结果与参比制剂最为相似，因此最终选择自制制剂的硬度为170 N。详见图4。

图4 在pH 1.2的盐酸溶液溶出介质中，片剂硬度对MET累积溶出度的影响

2.2 LGLT速释层的处方筛选

2.2.1 HPMC用量的考察 以PEG为增塑剂，参考参比制剂资料，选用HPMC作为助悬剂，其他辅料用量不变，考察不同HPMC用量对片剂溶出效果的影响。结果表明，HPMC的用量越多，药物的溶出越慢，当HPMC的用量为每片60 mg时，自制制剂的溶出曲线与参比制剂最为相似。因此最终选用HPMC的用量为每片60 mg。详见图5。

图5 在pH 1.2的盐酸溶液溶出介质中，HPMC的用量对LGLT累积溶出度的影响

2.2.2 增塑剂PEG用量的考察 以HPMC为助悬剂参考参比制剂资料，选用PEG作为增塑剂，其他辅料用量不变，考察不同PEG用量对片剂溶出效果的影响。结果表明，PEG的用量越多，药物的溶出越慢，用量为每片40 mg时，自制制剂的溶出曲线与参比制剂最为相似，因此最终选用PEG的用量为每片40 mg。详见图6。

图6 在PH1.2的盐酸溶液溶出介质中，PEG的用量对LGLT累积溶出度的影响

2.3 利格列汀二甲双胍缓释片的制备

2.3.1 MET缓释片的制备工艺 将MET过40目筛。取HPMC溶于纯化水中制成10%粘合剂溶液。在MET中缓慢加入粘合剂溶液，过40目筛湿法制粒，将制好的颗粒置于60 ℃恒温的条件下干燥1 h，过40目筛整粒，按照处方量加入PEO，最后加入硬脂酸镁，混合均匀，压片，调节硬度170 N，制得MET缓释片芯。

2.3.2 LGLT速释层包衣的制备工艺及参数 按照处方量配制LGLT速释层包衣溶液，使用高效包衣机上药，上药时包衣机参数为进风温度50 ℃，上下风量 1 800，转速10 ～ 12 r/min，喷液流速1 ～ 2 mL，制得LGLT药片，用薄膜包衣预混剂包薄膜衣，包衣时包衣机参数为进风温度45 ℃，实际温度为40 ℃左右，上下风量2 000，转速7 r/min，喷液流速1 ～ 2 mL，制得利格列汀二甲双胍包衣片。

2.4 自制制剂与参比制剂在不同pH值介质中的溶出度考察

取自制制剂和参比制剂，分别以纯化水、pH 1.2盐酸溶液、pH 4.5醋酸盐缓冲液和pH 6.8磷酸盐缓冲液为溶出介质，按照“1.3”项下方法，进行测定，分别比较自制制剂和参比制剂中主药LGLT和MET在不同pH值溶出介质中的溶出度，结果见图7，8。结果显示，LGLT和MET在pH 1.2盐酸溶液、pH 4.5醋酸盐缓冲液、pH 6.8磷酸盐缓冲液和纯化水的溶出条件下，参比制剂和自制制剂的溶出曲线相似，相似因子f2均 ＞ 50，故参比制剂和自制制剂的溶出行为一致。

图7 不同溶出介质中参比制剂和自制制剂的累积溶出（盐酸二甲双胍）

图8 不同溶出介质中自制制剂和参比制剂的累积溶出（利格列汀）

2.5 自制制剂与参比制剂在比格犬体内药动学试验结果

6只比格犬进行双交叉试验，分别口服自制制剂和参比制剂后，所得药动学数据见表1，2，血药浓度-时间曲线见图9，10。对MET生物等效性进行统计，在90%置信区间内，Cmax的上限为90.7%，下限为 114.1%；AUC0-t的上限为 84.0%，下限为117.1%；AUC0-∞的上限为83.4%，下限为120.0%。对LGLT生物等效性进行统计，在90%置信区间内，Cmax的上限为94.2%，下限为107.1%；AUC0-t的上限为90.6%，下限为124.0%；AUC0-∞的上限为91.2%，下限为123.9%。分析数据可知，参比制剂与自制制剂的药代动力学参数差异无统计学意义（P＞0.05），根据药物一致性评价常用的分析方法得知，2种主药的置信区间落在了80% ～ 125%范围内，因此，参比制剂与自制制剂在比格犬体内生物等效。

图9 比格犬给药后二甲双胍均值药时曲线图

表1 犬口服给予参比制剂或自制制剂后二甲双胍主要药动学参数（n = 6，）

表1 犬口服给予参比制剂或自制制剂后二甲双胍主要药动学参数（n = 6，）

组别参比制剂自制制剂Cmaxt /（ng/mL）5 895.3 ± 1 009.2 5 980.5 ± 1 186.8 AUC0-t /（h · ng/mL）41 810.9 ± 15 145.3 43 738.7 ± 16 635.7 AUC0-∞t /（h · ng/mL）42 102.9 ± 15 069.1 44 257.7 ± 16 844.1

表2 犬口服给予参比制剂或自制制剂后利格列汀主要药动学参数（n = 6，）

表2 犬口服给予参比制剂或自制制剂后利格列汀主要药动学参数（n = 6，）

组别参比制剂自制制剂Cmaxt /（ng/mL）21.78 ± 5.48 22.02 ± 5.14 AUC0-tt /（h · ng/mL）121.69 ± 19.54 121.92 ± 26.15 AUC0-∞t /（h · ng/mL）131.28 ± 20.97 132.86 ± 29.55

图10 犬给药后利格列汀均值药时曲线图

3 讨 论

本研究建立了利格列汀二甲双胍缓释片体外溶出度的HPLC分析方法，该方法简便、准确，适合利格列汀二甲双胍体外溶出度的测定。MET的可压性差，因此选择湿法制粒的方式将MET制备成过40目的颗粒，与PEO混合后制备片剂，提高了其可压性和成型性。将PEO与颗粒混合均匀进行压片时，片剂硬度明显增加，方便后续的包衣。通过与参比制剂的溶出曲线进行对比，速释层确定了HPMC、PEG等辅料的最佳用量以及包衣上药的关键工艺参数。

将自制制剂与参比制剂在4种不同pH溶出介质中的溶出曲线进行比较，结果表明在4种溶出介质中，自制制剂和参比制剂中2种主药的溶出曲线相似，相似因子f2均 ＞ 50。对犬体内药动学实验数据进行分析，与参比制剂相比，自制制剂中2种主药在犬体内的Tmax较短，Cmax、AUC0-t相当，说明在相同的时间内可以达到同样的有效浓度，2种主药的置信区间落在了80% ～ 125%范围内，通过比较Cmax、AUC的置信区间可得，参比制剂与自制制剂药代动力学性质基本一致，具有生物等效性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突