基于HPLC法和网络药理学研究蒲公英抗氧化活性成分及作用机制

潘明月 李涛 陈婉钰 张晓颖 龙生 吴禹岐 于睿 张蕾

摘要： 基于高效液相色譜（HPLC）法和网络药理学方法研究蒲公英中抗氧化活性成分及作用机制. 采用石油醚、 乙酸乙酯、 二氯甲烷和正丁醇等有机试剂分别提取中草药蒲公英的有效成分，研究其抗氧化效果，同时采用网络药理学多个在线数据库获取蒲公英抗氧化共有靶点，构建 PPI网络，并进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析.  结果表明： 蒲公英各相提取物对羟自由基（ ·OH）、 超氧阴离子自由基（O2- ·）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH ·）均有一定的清除能力，蒲公英乙酸乙酯相提取物和蒲公英二氯甲烷相提取物的清除效果较好，主要的抗氧化活性成分为异鼠李素和齐墩果酸； 线上数据库筛选出蒲公英抗氧化靶点有137个，共有靶点主要集中在膜筏上，通过细胞对无机物、 氮化物和营养水平的反应起抗氧化作用；  共有靶点与癌症信号通路、 NF-κappa B信号通路和PPAR信号通路等密切相关.

关键词： 高效液相色谱； 网络药理学； 蒲公英； 抗氧化

中图分类号：  R284   文献标志码： A  文章编号： 1671-5489（2023）02-0437-06

Study of Antioxidant Active Components and Mechanism of Dandelion Based on HPLC Method and Network Pharmacology

PAN Mingyue， LI Tao， CHEN Wanyu， ZHANG Xiaoying， LONG Sheng， WU Yuqi， YU Rui， ZHANG Lei

（Department of Pharmaceutical Engineering， School of Life Science and Technology， Mudanjiang Normal University， Mudanjiang 157011，Heilongjiang Province，China）

收稿日期： 2022-05-13.

第一作者简介：   潘明月（2000—），女，汉族，硕士研究生，从事生化药学的研究，E-mail：  1765134763@qq.com. 通信作者简介：  张 蕾（1984—），女，汉族，博士，副教授，从事微生物与生物化学的研究，E-mail： swxzlz@126.com.

基金项目： 黑龙江省基本科研业务费（批准号： 1452PT007； 1354MSYQN024; 1354MSYQN025）、 黑龙江省博士后基金（批准号： LBH-19190）、 黑龙江省大学生创业实践项目（批准号： kjcx2021-082mdjnu）和黑龙江省大学生创新项目（批准号：  S202210233032; MSYSYL2022019）.

Abstract：  We studied  the antioxidant active components and mechanism of  dandelion based on  high performance liquid chromatograph （HPLC） method and network pharmacology method.   The effective components of Chinese herbal medicine dandelion were extracted by  organic reagents， such as petroleum ether， ethyl acetate， dichloromethane and n-butanol， and their antioxidant effects were studied. Multiple online databases of network pharmacology were used to obtain  common targets of dandelion antioxidant construct PPI network， and conduct GO enrichment analysis and KEGG signal pathway enrichment analysis. The results show that the  extracts of each phase of dandelion have a certain scavenging ability to hydroxy radical （

·OH）， superoxide anion radical （O2-

·） and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH

·）， the ethyl acetate phase extract of dandelion and the dichloromethane phase extract of dandelion have better scavenging effects， and the main antioxidant active components are isorhamnetin and oleanolic acid. There are 137 dandelion antioxidant targets screened from the online database. The common targets are mainly concentrated on membrane rafts， which are resistant to the response of cells to inorganic substances， nitrogen compounds， and nutrient levels oxidation. The common targets are closely related to cancer signal pathway， NF-kappa B signal pathway， and PPAR signal pathway.

Keywords：  high performance liquid chromatography （HPLC）;  network pharmacology; dandelion;  antioxidant

蒲公英（dandelion）为菊科多年生宿根性植物，别名灯笼草、 婆婆丁、 华花郎等［1］，具有解热凉血、 补脾和胃、 利尿缓泻等功效，多用于炎症、 瘰疬、 疔毒疮肿、 尿路感染等多种疾病的治疗［2-6］. 传统中药大多是天然的抗氧化剂，在清除自由基、 抗氧化方面具有重要作用. 这些功能与其中的生物活性物质密不可分，包括黄酮类化合物、 甾醇、 皂苷、 生物碱、 菊糖、 酚类化合物、 萜类等［1-3］. 研究表明，蒲公英作为一种中草药具有副作用低的优点，因此广泛应用于天然药物的开发和应用. 本文通过使用不同有机溶剂提取中草药蒲公英中的多种有效成分，采用不同方法研究各种提取物的抗氧化效果，并基于网络药理学鉴定其作用靶点和机制，从而为探索蒲公英药用成分防治相关临床疾病机理的研究提供参考数据.

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

蒲公英购自牡丹江大药房； 各种有机试剂购自北京化工厂； 异鼠李素和齐墩果酸购自贵州迪大生物科技有限公司；  1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和邻苯三酚购自成都生物股份有限公司.

2665型高效液相色谱仪（美国Waters公司）； SP-756P型紫外可见光光度计（上海光谱仪器有限公司）.

1.2 实验方法

1.2.1 制备蒲公英提取物

将1.8 kg蒲公英粉碎，过200目筛后用体积分数为95%的乙醇浸泡24 h，浸泡过程中间歇搅拌，重复浸提3次， 采用旋蒸浸提液的方法得到蒲公英乙醇浸膏.

将蒲公英乙醇浸膏用石油醚、 二氯甲烷、 乙酸乙酯和正丁醇4种不同极性的有机溶剂进行萃取至无色，收集各有机相萃取液，分别得到蒲公英正丁醇相（主要含极性较大的物质）、 蒲公英二氯甲烷相（主要含黄酮类和生物碱类化合物）、 蒲公英乙酸乙酯相（主要含有机酸类和香豆素类化合物）和蒲公英石油醚相（主要含油脂和三萜类化合物［7］）.  旋蒸萃取液，得到浸膏，蒸干，最终获得蒲公英石油醚相提取物11.41 g、 乙酸乙酯相提取物14.05 g、 二氯甲烷相提取物8.02 g和正丁醇相提取物12.09 g. 称取1 mg的蒲公英各有机相提取物溶解后，配制成质量浓度分别为0.8，0.6，0.4，0.2 mg/mL的提取物待测溶液.

1.2.2 提取物的抗氧化效果

1） 清除羟基自由基（ ·OH）.  在正常有氧代谢过程中， ·OH是一种代谢的副产物. 在一定条件下， 当机体内线粒体中的过氧化物和H2O2酶活力降低时，H2O2和超氧化物会增加，二者使更具活力的 ·OH也增加，从而使细胞受到更大的损伤. 本文基于邻二氮菲与Fe2+形成氧化还原指示剂配合物的原理，测定不同质量浓度的蒲公英各相提取物对 ·OH的清除效果［7］.

2） 清除超氧自由基（O2- ·）. 超氧自由基也称为过氧自由基，可导致人体免疫力低下、 疲劳、 器官病变、 心血管疾病、 癌症和糖尿病等，严重危害人体健康. 本文参考文献［7］的方法，利用加入抗氧化物质可降低邻苯三酚自氧化速率的原理，分别检测不同质量浓度样品中O2- ·的含量，根据公式计算蒲公英各相提取物对O2- ·的清除率. 3） 清除DPPH自由基（DPPH ·）.  DPPH ·是一种以氮为中心稳定的自由基，其稳定性依赖于3个苯环的共轭效应以及空间上的阻滞，这种阻隔可使未与氮原子成对的电子形成适当配对. 由于分子中含有N，O和C等极性基团，因此具有较强的氧化还原性能，并且容易被还原生成相应的醛和酮.

参考文献［8］的方法，取3支具塞试管，分别标记为1，2，3. 向1号试管中加入DPPH溶液（2.5 mL）和蒲公英不同相提取物溶液（1.5 mL）， 向2号试管中加入DPPH溶液（2.5 mL）和体积分数为95%的乙醇溶液（1.5 mL）， 向3号试管中加入蒲公英不同相的提取物溶液（1.5 mL）和体积分数为95%的乙醇溶液（2.5 mL），黑暗条件下反应20 min. 分别用分光光度计检测1～3号试管中溶液的OD525吸光值. 根据文献［8］中公式计算DPPH ·的清除率.

1.2.3 HPLC条件

采用高效液相色谱（HPLC）法检测蒲公英活性物质，色谱柱为C18柱. 齐墩果酸流动相： V（乙腈）∶V（水）=9∶1，检测波长为210 nm； 异鼠李素流动相为V（甲醇）∶V（（φ=0.4%）磷酸）=45∶55. 检测波长为360 nm，流速为1 mL/min，柱温为室温（约24 ℃），进样量为10 μL，平行进样3次.

1.2.4 蒲公英抗氧化相关靶点及通路分析

基于Symmap数据库（https：//www.symmap.org）获取蒲公英活性成分，并通过Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）和SwissTargetPrediction（https：//swisstargetprediction.ch）获取蒲公英有效靶点. 基于GeneCards數据库（https：//www.genecards.org）获取抗氧化的相关靶点. 将上述得到的靶点分别输入Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）中，筛选出蒲公英抗氧化共有靶点. 将其输入Metascape数据库（https：//metascape.org）以及KOBAS（https：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3）中分别进行GO和KEGG富集分析，其中P≤0.01.

1.3 统计分析

采用SPSS15.0软件进行数据统计分析.

2 结果与讨论

2.1 蒲公英各相提取物的抗氧化效果

研究表明，蒲公英各相提取物对 ·OH，O2- ·和DPPH ·均有一定的清除能力，如图1所示. 由图1可见，蒲公英乙酸乙酯相和二氯甲烷相提取物的清除效果较好，当ρ（乙酸乙酯相）=0.6，0.8 mg/mL时，对 ·OH，O2- ·和DPPH ·的清除率分别为76.09%和89.74%，53.48%和56.12%，92.34%和86.48%；  ρ（二氯甲烷相）=0.6，0.8 mg/mL时，对 ·OH，O2- ·和DPPH ·的清除率分别为68.8%和70.6%，63.95%和68.71%，76%和79.57%，与1 mg/mL Vc溶液对三者的清除率相近.

2.2 HPLC检测蒲公英活性物质结果

通过高效液相法绘制标准曲线，齐墩果酸： y=4 654.1x-6 510.7，R2=0.998 2； 异鼠李素： y=13 501x+349 330，R2=0.999 1. 研究表明： 黄酮类化合物具有抗氧化效果［8］，本文通过反高效液相色谱法发现在蒲公英乙酸乙酯相提取物中存在大量的异鼠李素，其保留时间为16.960 min，质量比为1.26 g/kg，得率为0.09%；  药物植物中三萜类化合物具有一定的抗氧化效果［8］，在蒲公英各相提取物中均存在一定量的齐墩果酸，其中在乙酸乙酯相和二氯甲烷相中含量较大，乙酸乙酯相中齐墩果酸的质量比为0.96 g/kg，得率为0.07%，二氯甲烷相中齐墩果酸的质量比为0.85 g/kg，得率为0.1%.

2.3 蒲公英抗氧化的相关靶点及富集分析

检索Symmap数据库并筛选得到蒲公英有效成分9种，有效靶点487个，有效成分包含槲皮素、 β-谷甾醇、 甜菜碱、 亚麻酸、 咖啡酸乙酯、 菊花黄素、 咖啡酸甲酯、 蒲公英赛醇和叶黄呋喃素. 检索GeneCards数据库并筛选得到抗氧化靶点1 027个，取交集得共有靶点为137个，如图2（A）所示. 在String数据库中得到靶点互作关系，用Cytoscape可视化有效成分和靶点关系图，如图2（B）所示. 对共有靶点进行GO富集分析，结果表明， GO富集分析主要集中在膜筏上，蒲公英通过细胞对无机物的反应、 对氮化物的反应和对营养水平的反应起抗氧化作用. KEGG 通路富集分析表明，蒲公英抗氧化与癌症信号通路、 NF-κappa B信号通路和PPAR信号通路等密切相关，如图3所示.

a. 对无机物质反应; b. 细胞对氮化合物反应; c. 防御反应调节; d. 通过细胞调节分泌物; e. 细胞对有机环状化合物反应; f. 细胞迁移正向调节; g. 循环系统过程; h. 对氧气水平降低反应; i. 对营养水平反应; j. 对异种生物质刺激反应; k. 蛋白磷酸化调节; l. 丝氨酸蛋白/苏氨酸蛋白/酪氨酸激酶蛋白活性;  m. 生长调节; n. 有机羟基化合物代谢过程; o. 小分子代谢过程调控; p. 腺体发育; q. 对β-淀粉样蛋白反应; r.  膜筏; s. 活性氧代谢过程调控; t. 节律过程.

目前，我國约有70种蒲公英，其分布广泛，主要生长在中、 低海拔地区的山坡路边、 田野、 草地和河滩等地. 蒲公英化学成分较复杂， 有酚酸类、 黄酮类、 多糖类、 酚类化合物、 三萜、 氨基酸、 脂肪酸、 木质素、 生物碱和矿物质等. 目前研究较多的黄酮类化合物有咖啡酸、 木犀草素、 绿原酸和异鼠李素等成分［9-10］. 本文研究表明： 在蒲公英乙酸乙酯相提取物中含有一定量的异鼠李素，但没有槲皮素、 金丝桃苷和山奈酚等几种黄酮类化合物； 在二氯甲烷相和乙酸乙酯相提取物中检测到三萜类成分齐墩果酸.

人体生命活动过程中产生的自由基可破坏机体的组织和细胞，阻碍细胞间的通讯，损伤机体的代谢功能，从而导致疾病发生，这也正是清除自由基和提高抗氧化作用受到人们重视的原因［11］. 已有研究表明蒲公英具有一定的抗氧化效果［12-13］，本文证明蒲公英二氯甲烷相和乙酸乙酯相提取物对 ·OH，O2- ·和DPPH ·均有不同程度的清除能力. 齐墩果酸和异鼠李素具有体外清除自由基的效果［14-17］;  齐墩果酸具有清除 ·OH和O2- ·的能力，且具有剂量依赖性； 异鼠李素作为一种黄酮类化合物具有清除DPPH ·和ABTS ·的能力，且随着浓度增加抗氧化效果增强， 异鼠李素也可抑制体外肝脏线粒体脂质的过氧化［18］. 本文中蒲公英二氯甲烷相和乙酸乙酯相提取物的抗氧化效果相对较强，这可能是与其活性成分齐墩果酸和异鼠李素的抗氧化作用有关.

网络药理学研究表明，蒲公英的有效成分主要包括槲皮素、 甜菜碱、 亚麻酸、 β-谷固醇等，其中STAT3，MAPK1，MAPK3，VEGFA，AKT1，SRC和ESR1等多种靶点相互作用使其具有抗氧化的作用. 如VEGFA作用于内皮细胞可诱导血管生成、 内皮细胞生长、 促进细胞迁移、 抑制细胞凋亡［19］； MAPK1和MAPK3均为一种细胞外信号调节激酶，其参与细胞的增殖、 分化、 转录和调控，并最终影响个体发育和组织器官再生等［20］. 这些靶点大多数富集在HIF-1、 癌症通路和内分泌抵抗等信号通路上. 其中共有20个靶点富集在内分泌抵抗信号通路上. ERBB2突变会导致乳腺癌病人发生内分泌抵抗，ERBB2扩增和表达上升将会为乳腺癌的治疗增加不可预测性［21］. 有42个靶点聚集在癌症通路上，在缺氧时调节VEGF的信号传导途径中， HIF-1起中枢纽带作用，可使VEGF的mRNA稳定性增加并增加VEGF的转录活性，抑制VEGF途径被确认为是一种有效的抗癌模式. Src基因产物c-Src在人类多种肿瘤细胞中过度表达并高度激活，研究Src抑制剂可为治疗多种癌症提供新的可能. 这些都预示蒲公英将有可能通过调节机体的氧化应激损伤起到治疗癌症的作用［22］.

综上所述，蒲公英各相提取物均具有不同程度的抗氧化作用，其中乙酸乙酯相提取物的抗氧化效果最佳，这是齐墩果酸和异鼠李素的抗氧化作用所致. 蒲公英的抗氧化功能通过多靶点、 多通路相互作用和共同调节完成，其抗氧化作用可能对乳腺癌和其他多种癌症的治疗有效.

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（责任编辑： 单 凝）