miR-34a-5p模拟物与KRASG12C抑制剂ARS-1620协同用药对非小细胞肺癌转移效果的研究

庞晓晓 袁浩栋 王辉 徐国新

[关键词]微小RNA-34a-5p；间质表皮转化因子；ARS-1620；转移；非小细胞肺癌

肺癌是全球范围内常见肿瘤，发病率位列所有肿瘤第三位，其中非小细胞肺癌（non-small-celllungcancer，NSCLC）是其最常见的组织学类型，现已构成严重的全球健康问题[1-2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类对基因表达有调节作用的非编码小分子RNA，其主要调控靶基因蛋白表达从而调节增殖、凋亡等多种细胞生物学功能[3-5]。据分析，miR-34a和miR-4664-3p、let-7a-2-3p等miRNAs联合使用显著抑制肿瘤增殖[6]。在抗NSCLC肿瘤细胞转移方面，miR-34a与多种药物协同作用效果显著。KRAS基因突变被认为是NSCLC的预后不良因素，其中G12C位点突变约占14%[7-8]。因此临床已将KRASG12C作为一个极好的肺癌治疗靶点。KRASG12C抑制剂ARS-1620是一种快速持续占据靶点的高效价共价化合物，它通过抑制KRASG12C激活从而阻断RAS-RAF-MEK-ERK信号传递，在小鼠移植瘤模型中已证实其抑制人类胰腺癌和结直肠癌细胞系生长的能力[9]。由此，本研究将探究miR-34a通过调控靶基因与ARS-1620协同作用时对KRASG12CNSCLC转移的影响，为临床治疗KRASG12CNSCLC提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

NSCLC细胞株：H2030与人正常肺上皮细胞Beas-2b均购于中国上海富衡细胞库。miR-34amimic（miR10000255-1-5）由广州锐博生物技术有限公司合成，Lipo2000（11668027）购于Invitrogen；ARS-1620（S8707）购于SELLECK生物科技有限公司；4%多聚甲醛（P0099）和结晶紫染液（C0121）购于碧云天生物技术有限公司；PCR试剂盒等（RR820A，638315）购于TaKaRa生物技术有限公司。MET（8198S）、β-actin（3700T）抗体等购于赛信通生物试剂有限公司（CST）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 将含10%胎牛血清的DMEM完培于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养细胞。将ARS-1620[溶于二甲基亚矾（DMSO）中]直接滴加于培养基，工作浓度为300nM。转染过程是分别将浓度0、50、100、150nM的miR-34a-5pmimic和Lipo3000分别加入120μlDMEM基培中，混匀室温静置20min后将缓慢加入已接种细胞的6孔板内。

1.2.2 生物信息学分析 DAVID（thedatabaseforannotation，visualizationandintegrateddiscovery）分析miR-34a靶基因调控功能。TCGA（thecancergenomeatlas）下载肺癌表达差异基因，R语言制作火山图（筛选条件为foldchange=2，adj.P=0.001），GEO数据库下载关于肺癌转移的系列：GSE42407（筛选条件为|logFC|>1，adj.P<0.01）。

1.2.3 Transwell实验 将细胞悬液200μl接种于Transwell上室中，下室加500μl培养基于24孔板并于培养箱孵育18～24h。将上下室培养基吸尽，加入4%多聚甲醛固定细胞，15min后再用结晶紫染色。

1.2.4 荧光素酶报告基因实验 将MET3UTR克隆至报告基因pmiR-RB-Report?的hRluc（海肾荧光素酶）基因下游，构建双报告基因载体（MET3UTR靶位点：51-57：CACTGCC，突变靶位点：51-57：CACTGCC）。将基因载体与miR-34amimic或阴性对照共转染293T细胞并测定荧光素酶活性。

1.2.5 qRT-PCR 反应条件为预变性95℃30s；循环40次；95℃5s；60℃30s。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.2.6 （WesternBlot）WB 将上清注入电泳槽中，90V电泳1.5h，90V2h转至PVDF膜，结束后用5%脱脂牛奶室温封闭2h，加入一抗4℃孵育过夜，次日加入荧光素标记二抗，扫膜仪成像。

1.3 统计学处理

采用GraphPadPrism7.0软件及SPSS26.0进行图片处理及数据统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较比较采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达miR-34a抑制H2030转移

qRT-PCR结果显示：与人正常肺上皮细胞Beas-2b比较，H2030中miR-34a表达（0.13±0.10）下降，差异有统计学意义（t=15.820，P=0.004）。见图1A。Transwell实验结果显示：miR-34amimic组（1035.00±61.81）细胞转移数量低于空转mock组（1321.00±107.50），差异有统计学意义（t=4.931，P=0.039）。见图1B。

2.2 生信分析筛选并验证miR-34a靶基因

通过TargetScan、miRDB、PicTar预测miR-34a靶基因并交集得出125个基因（图2A）。通过DAVID预测miR-34a靶基因涉及迁移功能（图2B）。将来自TCGA数据库肺癌表达上调差异基因、GSE42407有关基因以及125个靶基因交集得出11个基因，分别为F2RL2、CCNE2、NRIP3、SEPT3、SEMA4B、ALDOA、BTBD11、ZFHX4、NAV1、JAG1、MET（图2C～D）。

选择MET进行下一步实验，荧光素酶报告基因实验显示，相对于MET-WT+NC（1.00±0.07），MET-WT+miR-34a组相对荧光值下降（0.57±0.02），差异有统计学意义（t=7.954，P=0.015），提示miR-34a负调控靶基因MET表达。见图3A。qRT-RCR结果显示：miR-34amimic（100nM）组（0.49±0.05）中METmRNA表达低于对照mock组（1.18±0.09），差异有统计学意义（t=19.570，P=0.003）（图3B）。WB结果显示，miR-34amimic（100nM）（0.49±0.03）组中MET蛋白表达低于对照mock组（0.79±0.03），差异有统计学意义（t=15.790，P=0.004，图3C）。

2.3 过表达miR-34a联合ARS-1620对H2030转移的影响

为了探究联合用药的效果，本研究分为con组、mock+DMSO组、miR-34a-5pmimic组、ARS-1620组和miR-34a-5pmimic+ARS-1620组Transwell实验结果显示，miR-34a-5pmimic+ARS-1620组（551.70±53.29）细胞转移数量显著低于mock+DMSO組（1421.00±28.02），差异有统计学意义（t=25.020，P<0.05）。见图4。

3 讨论

临床肿瘤治疗中常表现出对药物的耐药性，多种药物协同治疗是临床上的最优选择。miR-34a与其他药物协同治疗取得了一定效果，已有研究表明，治疗肺癌可协同多个miRNAs同时靶向多个致癌因子，由此癌症相关旁路同时被抑制，发生耐药的概率降低[6]。IGF1R、mTOR抑制剂和ARS-1620组合可抑制KRAS突变下游PI3K-AKT和RAF-MEK-ERK信号通路的传递，并完全抑制S6磷酸化，诱导肺肿瘤消退[9]。miRNAs是一类对基因表达有调节作用的非编码小分子核糖核酸，异常miRNAs通过其靶基因异常表达从而对细胞产生影响，导致许多疾病，如NSCLC[10-12]。miR-34a异常表达是NSCLC患者复发的不良预测因子，所以恢复miR-34a表达对于NSCLC治疗方面具有一定效果[13-14]。miR-34a靶基因MET是除EGFR、ALK和ROS1之后在NSCLC中的另一个重要肿瘤驱动基因和治疗靶点，抑制MET蛋白表达对治疗NSCLC有一定效果[15]。本研究发现，miR-34a在H2030中表达下降，当恢复miR-34a表达后显著抑制MET表达并一定程度抑制癌细胞转移。本研究发现，KRASG12C抑制剂ARS-1620联合miR-34amimic共同作用于H2030可显著抑制其迁移，效果显著于单一使用miR-34amimic处理H2030。

综上所述，将miR-34a和KRASG12C作为靶点是一种很有前景的治疗方案。但NSCLC的发展涉及到复杂信号通路，需要和其他靶向药物甚至是放化疗整合到临床治疗方案中。如何将不同治疗方案结合起来将是临床的一个挑战。