槲皮素阻滞JAK2/STAT3信号通路对软骨肉瘤细胞迁移、侵袭和EMT的抑制作用研究

李毅 张恒 赵维彪

摘 要：為探究槲皮素对人软骨肉瘤细胞迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）的影响及对Janus激酶2/信号转导和转录启动因子3（JAK2/STAT3）信号通路的调控作用，体外培养人软骨肉瘤SW-1353细胞，用不同浓度槲皮素干预SW-1353细胞24 h，细胞计数试剂盒（CCK-8）法筛选出最适浓度（50.0 μmol/L）槲皮素进行后续试验。将细胞分为对照组（不做干预）、槲皮素组（50.0 μmol/L槲皮素）、阳性药物组（6.0 μmol/L阿霉素）、抑制剂组（50.0 μmol/L槲皮素＋50.0 μmol/L JAK2/STAT3通路抑制剂AG490）和激活剂组（50.0 μmol/L槲皮素＋0.5 μmol/L JAK2/STAT3通路激活剂colivelin），干预24 h后，用倒置显微镜、Transwell小室及Western blot法对细胞形态、迁移、侵袭及JAK2/STAT3通路和EMT相关蛋白的表达水平进行分析。试验结果显示：CCK-8法确定槲皮素最适作用浓度为50.0 μmol/L；与对照组比较，槲皮素组和阳性药物组细胞生长受到抑制，细胞迁移数、侵袭数、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纤连蛋白（FN）、p-JAK2和p-STAT3表达水平降低（P<0.05），E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达水平升高（P<0.05）；与槲皮素组相比，抑制剂组上述指标变化趋势更为显著（P<0.05），激活剂组则扭转了这些指标的变化（P<0.05）。槲皮素可抑制人软骨肉瘤SW-1353细胞的生长、迁移、侵袭和EMT进程，其作用机制可能与阻滞JAK2/STAT3信号通路相关。

关键词：软骨肉瘤；槲皮素；JAK2/STAT3信号通路；迁移；侵袭

中图分类号：Q811.4                           文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.007

Effect of Quercetin on Chondrosarcoma Cell Migration， Invasion and EMT by Blocking JAK2/STAT3 Signaling Pathway

LI Yi1， ZHANG Heng2， ZHAO Weibiao1*

（1. Department of Orthopedics， Liaoning Jinqiu Hospital， Shenyang 110016， China; 2. Department of Pathology， the First Affiliated Hospital of China Medical University， Shenyang 110001， China）

Abstract： To investigate the effects of quercetin on human chondrosarcoma cell migration， invasion and epithelial interstitial transformation （EMT） and the regulatory role of Janus kinase 2/signal transduction and transcription promoter 3 （JAK2/STAT3） signaling pathway， human chondrosarcoma SW-1353 cells were cultured in vitro and treated with quercetin of different concentrations for 24 h. The optimal concentration of quercetin （50.0 μmol/L） was selected by cell counting kit （CCK-8） for subsequent experiments. The cells were divided into control group with no intervention， quercetin group with 50.0 μmol/L quercetin， positive control group with 6.0 μmol/L adriamycin， inhibitor group involving 50.0 μmol/L quercetin +50.0 μmol/L JAK2/STAT3 pathway inhibitor AG490， and activator group involving 50.0 μmol/L quercetin +0.5 μmol/L JAK2/STAT3 pathway activator colivelin. After 24 h of intervention， cell morphology， migration， invasion， and expression levels of JAK2/STAT3 pathway and EMT-related proteins were analyzed by inverted microscope， Transwell chamber and Western blot. The experimental results showed that the optimum concentration of quercetin was determined by CCK-8 method to be 50.0 μmol/L. Compared with the control group， the growth of quercetin group were positive control group were inhibited， the cell migration number， invasion number， expression levels of N-cadherin， Vimentin， fibronectin （FN）， p-JAK2 and p-STAT3 in quercetin group and positive control group decreased （P<0.05）， E-cadherin expression level increased （P<0.05）; compared with quercetin group， the change trend of the above indexes in inhibitor group was more significant （P<0.05）， while the change of these indexes in activator group was reversed （P<0.05）. Quercetin can inhibit the growth， migration， invasion and EMT progression of human chondrosarcoma SW-1353 cells， possibly by blocking the JAK2/STAT3 signaling pathway.

Key words： chondrosarcoma; quercetin; JAK2/STAT3 signaling pathway; migration; invasion

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 240-246）

软骨肉瘤（chondrosarcoma）是起源于软骨细胞的恶性骨肿瘤之一，其最常见的症状是局部性疼痛［1］。软骨肉瘤对放、化疗不敏感，耐药性强，通常采用手术广泛切除，但手术预后较差、极易复发［2-3］。因此，迫切需要寻找敏感性强、效价高、副作用低的抗肿瘤药物以治疗软骨肉瘤，而中医药在传统医学里已发展两千多年，有很多关于中药治疗软骨肉瘤的研究［4］。槲皮素（quercetin）是一种广泛存在于蔬菜和水果中的黄酮类化合物，具有降三高、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗炎、对神经和心脏有保护作用等多种特性［5-6］，而且还具有抗肿瘤活性［7］。有多项研究报道，槲皮素可以抑制卵巢癌［8］、前列腺癌［9］及骨肉瘤［10］等多种肿瘤细胞的侵袭和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。但槲皮素对软骨肉瘤细胞的抗肿瘤机制仍不十分明确，基于此，本研究利用槲皮素干预对软骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和EMT的作用机制做进一步的探讨，以期为槲皮素开发成肿瘤治疗新药提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人软骨肉瘤SW-1353细胞，购自武汉普诺赛生命科技有限公司；槲皮素、阿霉素（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%），Janus激酶2/信号转导和转录启动因子3（Janus kinase 2/signal transduction and transcription promoter 3，JAK2/STAT3）通路抑制剂AG490、激活剂colivelin（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥99%），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，美国Gibco公司），L-15培养基、RIPA裂解液、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）（艾美捷科技有限公司），结晶紫染色液［生工生物工程（上海）股份有限公司］，基质胶（美国ABC公司），JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纤连蛋白（fibronectin，FN）与β-actin一抗、二抗包括碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）标记的羊抗鼠IgG（H+G）和AP标记的羊抗兔IgG（H+G）、青霉素-链霉素溶液（100×）均来源于武汉三鹰生物技术有限公司。DXS_3型倒置荧光显微镜购自上海缔伦光学仪器有限公司，THZ-98A型二氧化碳培养箱购自上海博迅实业有限公司，Infinite F200型Spark多功能酶標仪购自帝肯（上海）贸易有限公司，GelDoc2000型凝胶成像系统购自美国Backman公司等。

1.2 方法

1.2.1 人软骨肉瘤SW-1353细胞培养

人软骨肉瘤SW-1353细胞生长于L-15培养基（含10% FBS、1×青-链霉素）中，并置于37℃、100%空气培养箱中培养，取对数生长期SW-1353细胞用于试验。

1.2.2 分组及给药

用不同浓度（12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 μmol/L）槲皮素干预SW-1353细胞24 h，对照组细胞不做干预，CCK-8法筛选出最适浓度（50.0 μmol/L）进行后续试验。再将细胞分为对照组（不做干预）、槲皮素组（50.0 μmol/L槲皮素）、阳性药物组（6.0 μmol/L阿霉素［11］）、抑制剂组（50.0 μmol/L槲皮素＋50.0 μmol/L JAK2/STAT3通路抑制剂AG490［12］联合干预）和激活剂组（50.0 μmol/L槲皮素＋0.5 μmol/L JAK2/STAT3通路激活剂colivelin［13］联合干预），干预24 h，每个试验重复3次，并设3个复孔。

1.2.3 CCK-8法测定人软骨肉瘤SW-1353细胞活性

细胞分组与给药方法同1.2.2，将对数期生长的细胞胰酶消化后用完全细胞培养液重悬，细胞传代并以5×103个/孔的密度铺于96孔板中。以不加细胞只加培养基的孔为空白组，药物处理24 h和48 h后，各孔加入体积分数为10% 的CCK-8溶液，孵育2 h后，检测各孔在450 nm的吸光度（optical density，OD）值。细胞活力/%=［（OD不同浓度槲皮素组－OD空白组）/（OD对照组－OD空白组）］×100%。

1.2.4 倒置显微镜观察人软骨肉瘤SW-1353细胞的形态

细胞分组与给药方法同1.2.2，在倒置显微镜下记录细胞形态。

1.2.5 Transwell小室法测定SW-1353细胞的迁移和侵袭能力

细胞分组及干预同1.2.2，各组细胞在药物干预24 h后，重悬在无血清的完全培养基中，并将1×105个细胞接种到Transwell小室的腔室中，Transwell小室和24孔板之间的腔室中加入500 μL含10% FBS的完全培养基。细胞在37℃中继续培养24 h，小室下表面的细胞与4%组织细胞固定液室温孵育15 min，再与1%结晶紫染色液室温孵育20 min。在侵袭能力分析试验时，小室提前用基质胶预处理，其他步骤相同。显微镜下记录采集图像；Image-J图像分析细胞迁移或侵袭数。

1.2.6 Western blot法检测SW-1353细胞中蛋白的表达水平

细胞分组与给药方法同1.2.2，收集各组细胞，并将细胞悬浮在预冷的放射免疫沉淀分析法（radio immuno precipitation assay，RIPA）裂解液中30 min，12 000 r/min冷冻离心10 min后收集上清液。目的蛋白先用凝胶电泳进行分离，后经聚偏二氟乙烯膜转印电泳、封闭、一抗孵育、二抗孵育及膜显色。在凝胶成像系统上采集蛋白条带并用系统配备的分析软件进行蛋白灰度值分析，以β-actin为内参。蛋白相对表达水平为目标蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值。

1.3 统计学分析

数据分析在SPSS 24.0软件上进行，符合正态分布的数据表示为平均数±标准差（x±s），数据分析多组间采用单因素方差分析，进一步两两比较用Students t检验。P<0.05代表具有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 槲皮素干预SW-1353细胞的作用浓度筛选

CCK-8法检测槲皮素对SW-1353细胞活力的影响（图1），结果显示：干预24 h时，与对照组相比，随着槲皮素作用浓度增加，细胞活力逐渐降低，其中12.5 μmol/L槲皮素组差异无统计学意义（P>0.05），25.0、50.0、100.0和200.0 μmol/L槲皮素组差异有统计学意义（P<0.05），100.0和200.0 μmol/L槲皮素细胞活力低于半抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）；干预48 h时，细胞降低趋势与干预24 h相似，25.0、50.0、100.0和200.0 μmol/L槲皮素均显著降低（P<0.05）。为了排除细胞活力对SW-1353细胞迁移和侵袭能力的影响，本研究选择了干预时间较短（24 h）、细胞活力显著降低且相较于IC50稍高的槲皮素浓度（50.0 μmol/L）。

2.2 槲皮素通过阻滞JAK2/STAT3通路抑制SW-1353细胞的生长

利用倒置显微镜观察了各组SW-1353细胞形态的变化发现，与对照组比较，槲皮素组、阳性药物组、抑制剂组细胞的生长受到抑制，激活剂组细胞生长抑制作用不明显，与槲皮素组相比，抑制剂组细胞生长抑制作用明显，具体情况见图2。

2.3 槲皮素通过阻滞JAK2/STAT3通路抑制SW-1353细胞的迁移

Transwell小室测定细胞的迁移能力显示，干预24 h，槲皮素组和阳性药物组迁移细胞数较对照组下调（P<0.05），抑制剂组迁移细胞数明显低于槲皮素组（P<0.05），激活剂组细胞迁移数明显高于槲皮素组（P<0.05），具体情况见图3。

2.4 槲皮素通过阻滞JAK2/STAT3通路抑制SW-1353细胞的侵袭

Transwell小室测定细胞的侵袭能力显示（图4），干预24 h，槲皮素组和阳性药物组侵袭细胞数均显著低于对照组（P<0.05），侵袭细胞数在抑制剂组明显低于槲皮素组（P<0.05），在激活剂组明显高于槲皮素组（P<0.05）。

2.5 槲皮素通过阻滞JAK2/STAT3通路抑制SW-1353的EMT进程

与对照组相比，E-cadherin蛋白表达水平在槲皮素组和阳性药物组上调，N-cadherin、Vimentin和FN三个蛋白水平在槲皮素组和阳性药物组下调（P<0.05）；较槲皮素组，E-cadherin蛋白水平在抑制剂组较高，在激活剂组较低，N-cadherin、Vimentin和FN在抑制剂组较低，在激活剂组较高（P<0.05），具体情况见图5。

2.6 槲皮素抑制SW-1353细胞中JAK2/STAT3信号通路的活化状态

为了研究槲皮素对JAK2/STAT3信号通路活化状态的影响，检测了该通路的关键性蛋白JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3的表达水平（图6a），蛋白定量分析结果显示（图6b）：各组之间JAK2和STAT3蛋白的表达水平无显著差异（P>0.05）；与对照组相比，槲皮素组和阳性药物组细胞p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达水平显著降低（P<0.05），与槲皮素组相比，抑制剂组p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达水平显著降低（P<0.05），激活剂组p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达水平显著升高（P<0.05）。

3 讨论

软骨肉瘤作为原发恶性骨肿瘤，多发生在股骨和骨盆等身体部位，早中期临床症状并不明显，大多患者发现时已发生转移，手术广泛切除对患者肢体功能具有严重的不良影响，且术后预后差、易复发［14］，因此，研究软骨肉瘤细胞的转移，对于患者治疗具有非常重要的临床意义。近几年，越来越多的医学研究倾向于开发防治肿瘤侵袭及转移相关的中医药物。中医学对骨肿瘤病因病机的认识，有“肾主骨”之说，故认为骨肿瘤的发生与肾精亏损、骨髓空虚有关，用中药治疗骨肿瘤能够起到清热解毒、驱邪扶正之功效［15］。槲皮素是植物中广泛分布的一种黄酮醇类化合物，毒副作用小，具有多靶點和不易耐药的优势，能够与其他药物协同发挥抗肿瘤作用［16］，近年来在前列腺癌［17］、乳腺癌［18］及食管癌［19］等细胞中被报道有抗癌作用。在骨肉瘤细胞的研究中，槲皮素对肿瘤细胞的抑制作用已有相关报道［20］，其抗肿瘤机制涉及细胞的迁移和侵袭等方面。本试验发现，槲皮素处理后，SW-1353细胞活力降低。为排除细胞活力对细胞迁移侵袭的影响，本研究选择对细胞活力有显著影响且浓度较低（50.0 μmol/L）的槲皮素进行试验，发现50.0 μmol/L槲皮素和6.0 μmol/L阿霉素对SW-1353细胞有相同的作用效果，均可抑制人软骨肉瘤细胞SW-1353的生长、迁移和侵袭能力，证明了槲皮素可以抑制软骨肉瘤细胞，有良好的医学应用前景。

JAK2/STAT3信号通路与肿瘤细胞周期、发生发展和耐药性等相关［21］。有研究报道，二氢杨梅素可通过调控JAK2/STAT3信号通路抑制人骨肉瘤MG-63细胞活性、侵袭和迁移能力［22］。槲皮素可阻断JAK/STAT通路抑制人宫颈癌C-33A细胞增殖并诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期等［23］，但槲皮素对软骨肉瘤细胞的作用机制并不明确。本文检测JAK2/STAT3通路关键蛋白结果显示，槲皮素组较对照组p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平降低，表明槲皮素可以抑制JAK2/STAT3通路。恶性肿瘤的特点除了生长速度较快之外，常伴随着侵袭、浸润转移等过程。作为恶性肿瘤预后的主要影响因素，侵袭与转移的发生与EMT密切相关［24］。在EMT生物学过程中，上皮细胞失去极性，细胞黏性降低，迁移和侵袭能力增强是发生肿瘤扩散的一个重要因素［25］。移志刚［26］发现，RIPK4抗软骨肉瘤作用与抑制EMT进程有关。本研究证实槲皮素对SW-1353细胞有抑制生长、迁移和侵袭作用后，发现槲皮素可抑制软骨肉瘤细胞的EMT进程。为了研究相关的作用机制，本研究加入了JAK2/STAT3通路抑制剂AG490和激活剂colivelin，发现与槲皮素组相比，抑制剂组抑制了SW-1353细胞的迁移及侵袭能力，增加了E-cadherin表达，降低了N-cadherin、Vimentin、FN及p-JAK2和p-STAT3表达水平，激活剂组结果与抑制剂组相反，提示槲皮素可能是通过JAK2/STAT3通路去调节SW-1353细胞的迁移、侵袭和EMT进程的。这与Wu等［27］在肝细胞癌LM3细胞中发现槲皮素通过消除JAK2/STAT3信号通路发挥抗肿瘤作用，以及与郑岩松等［28］发现的槲皮素在人肝癌SMMC-7721细胞中抑制EMT的进程结果相符。

综上所述，槲皮素可通过抑制JAK2/STAT3信号通路抑制人软骨肉瘤SW-1353细胞的迁移、侵袭和EMT进程，为软骨肉瘤靶向治疗提供新方向。但槲皮素对软骨肉瘤其他生物学特性的影响及相关分子机制仍需进一步研究。

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