斑马鱼wbp11基因敲除品系的建立游诗琦 陈宇 杨雪婷 李韵璇 乔卿 罗莹

姚梅英 高罗晴 刘欣 王跃群 吴秀山 李永青

摘 要：WBP11是WW结构域结合蛋白家族的一员，参与前体mRNA剪接过程，是重要的剪接因子。斑马鱼作为重要的模式生物之一，其基因组中含有人类WBP11的同源基因wbp11。为了研究WBP11在脊椎动物早期发育过程中的作用机制，利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼wbp11基因敲除品系。首先，在wbp11基因的第二个外显子上设计基因敲除靶位点，体外转录合成sgRNA，通过显微注射技术对斑马鱼进行基因敲除，得到F0代嵌合体斑马鱼。随后，将嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，所得到的F1代斑马鱼进行基因型鉴定，筛选出其中的杂合子斑马鱼，并对杂合子斑马鱼的缺失条带进行测序，结果显示其为wbp11基因的2种缺失突变。让同种突变的F1代杂合子斑马鱼自交，对得到的后代F2进行基因型鉴定，筛选获得了纯合子斑马鱼，表明wbp11基因敲除品系构建成功。经显微镜白光成像观察发现，受精后48 h的斑马鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲畸形，这可能是由于wbp11基因突变引起剪接機制异常所导致的。此研究为探究WBP11基因在脊椎动物的早期发育中的作用机制开辟了道路。

关键词：斑马鱼；wbp11；CRISPR/Cas9；基因敲除；杂合子

中图分类号：Q341；Q812                     文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.004

Construction of Zebrafish wbp11 Gene Knockout Line

YOU Shiqi1， CHEN Yu2， 3， YANG Xueting1， LI Yunxuan1， QIAO Qing1， LUO Ying1，

YAO Meiying1， GAO Luoqing1， LIU Xin1， WANG Yuequn1， WU Xiushan1， 3， LI Yongqing1?

（1. The Center for Heart Development， State Key Laboratory of Freshwater Fish Development Biology， Hunan Normal University， Changsha 410081， China; 2. Guangdong Cardiovascular Institute， Guangdong Provincial Peoples Hospital， Guangdong Academy of Medical Sciences， Guangzhou 510100， China; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenesis， Targeted Prevention and Treatment of Heart Disease， Guangzhou 510100， China）

Abstract： As a member of the WW domain binding protein family， WBP11 is an important splicing factor involved in the pre-mRNA splicing process. Zebrafish， one of the notable model organisms， contains orthological homologous gene wbp11 in its genome. In order to study the mechanism of WBP11 in the early development in vertebrates， a knockout strain of wbp11 in zebrafish was constructed using CRISPR/Cas9 technology. Firstly， gene knockout target sites were designed on the second exon of wbp11 gene， and sgRNA was synthesized by transcription in vitro. After microinjection technology， F0 generation chimeric zebrafish with wbp11-knockout was obtained. Then， the F1 generation zebrafish by crossing chimeric zebrafish with wild-type zebrafish were identified by genotype， and heterozygous zebrafish were screened out. The sequencing results for exact bands of heterozygous zebrafish showed that there were two strains with different sequence deletion. Heterozygous zebrafish of the F1 generation of the same strain were self-crossed. The homozygous zebrafish was screened out via genotyping， meaning the wbp11 gene knockout strain was successfully constructed. The zebrafish with 48 hours post fertilization showed pericardial edema， heart linearization and skeletal curvature obversed by microscopic white light imaging. These defections may be resulted from the abnormal splicing mechanism caused by the deletion of wbp11 gene. This study opens the way to explore the mechanism of WBP11 gene in the early development in vertebrates.

Key words： zebrafish; wbp11; CRISPR/Cas9; gene knockout; heterozygote

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 217-225）

WW结构域又被称为Rsp5或 WWP domain，是由30～40个氨基酸所组成的结构紧密的三股反平行β折板结构域［1］。WW结构域具有特异专一性，能够与富含脯氨酸序列（XPPXY）的蛋白质分子（P：脯氨酸，Y：酪氨酸，X：任意氨基酸）作用，广泛存在于真核生物中，在蛋白质降解、转录和RNA剪接等多种细胞功能的调控中发挥重要作用［2］。而WW结构域结合蛋白家族，顾名思义，它们识别并结合含有WW结构域的蛋白质。其家族成员WW结构域结合蛋白11（WW domain binding protein 11，WBP11），参与前体mRNA剪接过程［3］。真核生物mRNA成熟前需要在细胞核中经过前体mRNA的剪接加工过程，即前体mRNA在剪接复合体的作用下，通过精确识别移除内含子并把外显子进行拼接而得到成熟的mRNA，成熟mRNA再转运出细胞核在核糖体被翻译成蛋白质［4］。基因的剪接是重要的转录后调控，对于基因的差异表达、组织器官的发育调控以及正常功能的维持具有重要的生理意义［5-7］。WBP11与 E3泛素连接酶PRP19（pre-mRNA processing factor 19）剪接体复合物相关，并共定位于富含剪接因子的核斑点［8-10］。该复合物是一种动态剪接核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）复合物，负责去除非编码片段、外显子连接（编码片段）和调节前体mRNA的可变剪接［11-13］。

目前对于WBP11基因的功能研究非常少。已有研究显示，在人类和小鼠中，WBP11基因突变会导致人类出现多种先天性异常，包括先天性心脏病、椎体异常、食道异常、肾脏异常等，该基因突变的小鼠也表现出类似的先天性异常，但未发现有心脏畸形［14］。对于WBP11基因在其中的作用機制还未有研究，也不清楚WBP11突变体在心脏发育中的不同表现是由于物种差异还是其他原因所致。而作为重要模式生物的斑马鱼wbp11基因是人类和小鼠WBP11基因的直系同源基因，因此，我们首次使用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼的wbp11基因进行特异性敲除，以获得wbp11基因缺陷的突变体斑马鱼，从而为进一步探究wbp11基因突变对斑马鱼早期的生长发育所造成的影响以及其生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验使用的AB品系野生型斑马鱼（Barchydanio rerio var）由本实验室繁殖饲养，水温约28.5℃，采取14 h光照/10 h黑暗光周期，pH值维持在6.8～7.5。斑马鱼胚胎置于E3 Buffer，在28.5℃恒温培养箱中孵育，4～6 d开始喂食草履虫（Paramoecium caudatum），12 d开始草履虫和丰年虾（Artemia salina）混合喂养，15 d转移到养殖系统中，直至3个月性成熟，成鱼早中晚各喂食1次。

研究所用仪器与试剂：多聚酶链式反应仪，移液器和分光光度计（Eppendorf公司）；斑马鱼养殖系统（北京爱生科技发展有限公司）；离心机（Fresco生物）；凝胶成像分析系统（Tanon公司）；恒温培养摇床（HZQ-A）（江苏太仓仪器设备）；表型分析多倍显微镜（奥林巴斯公司）；倒置荧光体视镜（蔡司公司）；拉针仪（narishige）；pH计（320-S）（Barnstead）；显微注射仪（PLI-100A）（Harvard Apparatus）；精度分析天平（舜宇恒平）；DEPC水（0.1% DEPC溶于去离子水中）；E3 Buffer（5 mol/L NaCl溶液60 mL，1 mol/L KCl溶液10 mL，1 mol/L MgSO4 20 mL，CaCl2 2.94 g，甲基蓝精粉1.00 g，去离子水定容至600 mL）；LB培养基（luria-bertani medium，肉汤培养基）（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，固体培养基则再加15 g琼脂，去离子水定容至1 L）；2.0%琼脂糖胶（2 g琼脂糖，100 mL去离子水）；TrueCut? Cas9 蛋白（Thermo Fisher）；T7转录试剂盒（Promega公司）；pMD?18-T Vector Cloning Kit（宝生生物公司）；RNA提取试剂盒（迅捷生物公司）；逆转录试剂盒（兰博利德公司）；纯化试剂盒（OMEGA公司）。

1.2 设计sgRNA靶位点

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中找到斑马鱼wbp11基因组序列（Gene ID： 402950），并通过Ensembl数据库对wbp11基因组进行分析，选择靶位点。靶位点引物序列与T7启动子序列以及guide RNA（gRNA）骨架连接，以带有gRNA骨架的p42250酶切后的产物为模板，扩增wbp11 sgRNA。用primer 5.0软件根据sgRNA的位置设计鉴定引物和实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）引物。本试验涉及的引物序列见表1。

1.3 靶位点sgRNA的PCR扩增与回收

p42250质粒经Bsa I酶切线性化后纯化作为扩增模板，构建50 μL的PCR体系（其中2×buffer 25 μL，sgRNA-F/sgRNA-R均2 μL，线性化的p42250模板2 μL，dNTP各1 μL，ddH2O补齐至50 μL）进行扩增，依照Rapid Taq Master Mix设置常规PCR程序，退火温度为60℃，延伸时间为15 s，设置30～35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用纯化试剂盒回收。

1.4 sgRNA的转录合成与纯化回收

纯化后的sgRNA产物利用T7转录试剂盒进行体外转录，全程注意RNA-free操作，取1 μL进行琼脂糖凝胶电泳（200 V）快速检测，确认转录成功后进行RNA纯化，并测定其浓度。

1.5 显微注射

注射的前天晚上，喂食10 min后將雌鱼和雄鱼按1：1或2：1的比例放入杂交缸中，用挡板隔开，10 h暗处理后，光照20 min，抽出挡板并给予强光刺激，在产卵后10 min后开始收集1细胞时期的胚胎，并排列在注射皿上注射sgRNA和Cas9蛋白的混合样品（注射配比体系分别为100 ng/μL、250 ng/μL），之后将胚胎置于E3 Buffer中，28.5℃恒温培养，每天换水2次并及时处理死胚胎，以免滋生霉菌。

1.6 斑马鱼基因组提取与鉴定

3个月性成熟后，分别剪取未注射的野生型（wild-type，WT）斑马鱼和注射鱼成鱼的尾鳍，使用碱裂解法提取斑马鱼基因组，鱼尾鳍置于1.5 mL EP管中，加入90 μL浓度为50 mmol/L NaOH，沸水浴10 min，振荡离心；加入10 μL（1/10 NaOH）pH=8.0的Tris-HCl，1 200 r/min离心5 min；吸取上清作为PCR模板，进行PCR扩增鉴定。

1.7 TA克隆

将纯化后的目的PCR产物与pMD18-T连接，在1.5 mL的EP管中营造反应体系（其中pMD18-T Vector 1 μL，模板1～3 μL，Solution Ⅰ 5 μL，ddH2O补齐至10 μL），16℃处理2 h或4℃过夜，转化涂布LB氨苄固体培养基平板并在37℃培养12～16 h。

1.8 qRT-PCR

利用试剂盒提取受精后48 h（48 hours post fertilization，48 hpf）斑马鱼的总RNA，随后将其逆转录为cDNA。按照说明书提供的体系与程序进行qRT-PCR检测，选取gapdh作为内参基因，将wbp11基因的mRNA表达水平进行标准化，再利用GraphPad Prism 6.0软件进行数据分析。

1.9 显微镜观察

分别收集48 hpf的WT和显微注射的斑马鱼幼鱼，使用一次性吸管转移幼鱼至载玻片，在蔡司倒置荧光显微镜下观察，可用注射器针头拨动使幼鱼侧边身体向上，拍摄记录斑马鱼的机体发育情况。

2 结果分析

2.1 wbp11基因敲除靶位点的确定

首先，根据在NCBI和Ensembl网站的信息分析发现，wbp11基因包含9个外显子，第一个外显子序列太短，无法设计基因敲除靶位点，因此选择位于wbp11基因编码序列的第二个外显子设计敲除靶位点。其上游引物命名为sgRNA-F，下游引物命名为sgRNA-R，靶位点长20 bp（图1）。

2.2 wbp11基因敲除sgRNA的合成

以纯化的线性化p42250质粒片段为PCR模板扩增目的片段，纯化PCR产物后进行RNA体外转录，纯化后的sgRNA片段为100 bp左右，与预期相符（图2）。

2.3 wbp11基因敲除有效性鉴定及F0代突变等位基因嵌合体成年斑马鱼的筛选

本试验设计的敲除靶位点为20 bp，鉴定引物在野生型斑马鱼中扩增出的目的片段大小为378 bp，理论上敲除后的目的条带在358 bp左右，但由于CRISPR/Cas9产生的靶位点切口会触发斑马鱼体内的修复机制来进行修复，并且这种修复是随机的、不确定的，因此小于378 bp的条带都是阳性结果。电泳结果如图3所示：泳道1、3只有378 bp单一条带，为野生型；泳道2、4除了目的条带，还出现了比目的条带小且较近的亮度微弱的条带，说明敲除是有效的。

将F0代胚胎培养至3个月性成熟后，进行鉴定。部分琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示：泳道1、2、7只有378 bp的单一条带，无敲除效果；但是泳道3、4、5、6、8、9中在目的条带的下方还出现了一条亮度微弱的条带，显示敲除成功，获得F0代突变等位基因嵌合体斑马鱼。

2.4 wbp11突变等位基因的TA克隆和Sanger测序分析及wbp11突变等位基因杂合斑马鱼的筛选

由于F0代的成鱼是嵌合体，所产生的基因突变不一定能够遗传给后代，因此，需要进一步的鉴定wbp11突变等位基因杂合胚胎即F1代胚胎的遗传有效性。部分鉴定结果如图5所示：泳道1在目的条带下面还有一条与目的条带亮度均等的条带，显示为杂合胚胎；泳道2、3、4、5、6、7、8、9、10、11只有目的条带，显示为未突变胚胎。这表明F0产生的突变能够稳定遗传。

待F1代斑马鱼长至3个月后进行鉴定。部分鉴定结果如图6所示：泳道1、2、3、4、5、6、10、13、15只有野生型条带，显示为野生型斑马鱼；泳道7、8、9、11、12、14除了目的条带之外，还有一条小于野生型且亮度均等的条带，显示为杂合子斑马鱼。

为了确认wbp11基因敲除的条带的实际大小，本试验将上述显示敲除成功的杂合子（泳道7、8、9、11、12、14）的缺失条带送往公司进行Sanger测序。测序结果比对显示：泳道7、9为同一种类型缺失，缺失片段为27 bp（图7a）；而泳道8、11、12、14为另一种类型缺失，缺失片段也为27 bp（图7b），只是缺失的位点不同。最终在F1代斑马鱼中筛选出了2种不同类型的基因突变品系。

缺失片段均为27 bp，对缺失序列进行了序列分析，如图8所示，2个突变品系缺失27 bp后，均能导致后续翻译移码，蛋白质不能正常翻译。这表明构建的敲除品系缺失为有效缺失。

2.5 wbp11基因突变体纯合子的筛选及mRNA

表达量的检测

为了构建完整的斑马鱼基因敲除品系，将上述F1成鱼进行杂交得到F2代，并鉴定筛选其中的纯合突变体斑马鱼。以突变品系1为例，琼脂糖凝胶电泳结果如图9所示，泳道4、5、6、8、9、10、11、15、18为野生型斑马鱼，而泳道1、3、7、12、13、14、16、17、19、20为wbp11基因突变等位基因杂合斑马鱼，泳道2、21为wbp11突变等位基因纯合斑马鱼。此21条wbp11突变等位基因杂合斑马鱼自交所产生的F2后代中有9条野生型、10条突变杂合斑马鱼和2条突变纯合斑馬鱼，表明wbp11基因敲除品系构建成功。

随后检测了wbp11基因在野生型斑马鱼和突变品系1纯合突变斑马鱼中的表达量，结果如图10所示，纯合突变斑马鱼wbp11基因的表达量极其低下，表明基因敲除成功。

2.6 wbp11基因突变纯合斑马鱼呈现心脏、骨骼畸形

2种突变品系所表现出来的缺陷表型高度一致，选取突变品系1的wbp11-/-和野生型斑马鱼进行观察，发现该基因的突变导致胚胎发育到48 hpf时出现明显异常。白光成像侧面图（图11）显示，wbp11-/-斑马鱼出现心脏线性化、心包水肿、骨骼弯曲等畸形。

3 讨论

已有研究显示，WBP11基因敲低影响非洲爪蟾胚胎的早期发育，其中胚层标记WNT8、FGF4和CDX4的表达减少［15］。但对于WBP11基因在早期发育中的作用机制还未有报道。另有研究显示，人类WBP11基因突变会导致先天性心脏病的发生，而小鼠的wbp11突变纯合子胚胎出生后致死，杂合突变体胚胎出现脊椎、肾脏和食道的缺陷，脑部体积减少，但未观察到心脏畸形［14］。因此，无法通过小鼠模型来研究wbp11基因的突变对于小鼠心脏发育的影响。而斑马鱼作为模式生物，所产下的胚胎光学透明，可以定时定点地观察特定发育窗口期间斑马鱼胚胎的心脏形态、血液流动等发育情况［16-18］。并且，斑马鱼基因与人类基因具有70%的同源性［19-20］，除了研究胚胎发育外，还能够利用斑马鱼模型建立如肝癌发生［21］、遗传性肌肉疾病［22］、神经系统疾病［23］、心血管疾病［24-25］等多种人类疾病模型。因此，选择利用斑马鱼构建wbp11基因敲除品系，能为人类先天性心脏疾病提供可能的疾病动物模型，也能为查明WBP11基因在不同脊椎动物中是否发挥不同作用提供研究材料。

CRISPR/Cas9技术由于其简便、高效，已广泛应用于基因敲除品系的构建［26-27］。本试验利用CRISPR/Cas9技术敲除效率高、能稳定遗传的特点构建了斑马鱼wbp11基因敲除品系。在构建品系的过程中发现，F0代嵌合体测交后代中出现少量心脏畸形的胚胎。鉴定结果显示，畸形胚胎均为wbp11基因杂合突变体。检测F1代自交后代时，其野生型：杂合子：纯合子的比例约为5：5：1，较正常情况下1：2：1的比例相差较远，显示杂合子和纯合子成鱼的数量都明显较少。但在前期并未观察到胚胎或幼鱼大量死亡，也未发现纯合致死现象，推测可能是由于在胚胎发育早期，斑马鱼是通过扩散作用从水中吸收氧气，而不是依赖心血管提供氧气，即使是心血管严重异常的斑马鱼也能在整个胚胎发育和幼鱼阶段存活［28］，直到发育后期，wbp11基因突变对斑马鱼早期胚胎发育所造成的影响才显现出来。因此并未在早期发现大量的胚胎死亡，但随着幼鱼的进一步发育，幼鱼死亡数量增多，所得到的纯合子和杂合子成鱼数量均不符合孟德尔遗传定律。

48 hpf时期的斑马鱼心房、心室发育完成，可自由游泳，此时能更好地观察斑马鱼的心脏和骨骼形态［29］。在wbp11基因敲除的2个突变品系中，均观察到48 hpf的斑马鱼幼鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲等畸形，这表明，wbp11基因突变干扰了斑马鱼的早期胚胎发育，尤其是心脏发育。由此推测，wbp11基因突变后，斑马鱼心脏和骨骼发育相关基因的RNA剪接受到了影响，从而造成某些重要基因无法正常的转录翻译，继而影响了心脏、骨骼的发育。但在斑马鱼中并未观察到如小鼠一般的wbp11基因突变纯合致死的情况，推测可能是因为wbp11的主要功能是参与前体mRNA剪接，但组成剪接体并参与剪接的蛋白质并非wbp11一种，机体的剪接机制并未完全废除，可能在斑马鱼中存在某种还未发现的剪接代偿机制。WBP11（wbp11）基因在不同物种中所表现出的缺陷表型不一致，也有可能是由于物种差异性所引起的。而对于wbp11如何影响斑马鱼的心脏、骨骼发育的作用机制，是否还影响了其他器官的发育以及机体的剪接机制是否出现异常还有待后续的深入研究。

总之，本试验所构建的斑马鱼wbp11基因敲除品系为后续探究wbp11基因突变影响斑马鱼早期胚胎发育的作用机制打下了基础。

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