雪莲果提取物调控Nrf2/HO-1/NLRP3通路改善大鼠急性肝损伤的作用机制研究

陈顺芝 冯玲 杨琪 张紫玉 吴蒸丽 张永勤

摘 要：基于Nrf2/HO-1/NLRP3通路探究雪蓮果提取物治疗四氯化碳（CCl4）致急性肝损伤（ALI）大鼠的保护作用及机制。选取48只健康雄性SD大鼠，随机分为6组，分别为对照组、模型组、雪莲果低中高剂量组和水飞蓟素阳性组。利用CCl4构建急性肝损伤模型后处死大鼠取材，检测大鼠血清和肝脏生化指标，利用HE染色观察各组肝脏组织病理学改变情况；利用ELISA检测大鼠血清中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达水平；采用蛋白免疫印迹法测定大鼠肝组织中Nrf2/HO-1/NLRP3通路关键基因蛋白含量表达情况。结果表明：与正常对照组比较，模型组大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT、MDA、IL-6和TNF-α的表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）；肝脏组织中SOD和GSH的表达水平均显著降低（P<0.05），大鼠肝组织细胞出现明显的病理性损伤（P<0.05）；与模型组比较，雪莲果提取物能够呈剂量依赖性降低大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT、IL-6和TNF-α的表达水平（P<0.05或P<0.01），以及提高肝脏组织中SOD、CAT、GSH和降低MDA的表达水平（P<0.05），大鼠肝组织病变程度明显改善，肝脏内细胞坏死和肿胀程度明显减轻，炎症细胞浸润得到显著改善。水飞蓟素阳性组能够显著改善大鼠肝损伤（P<0.05或P<0.01）。雪莲果提取物组与模型组比较，Nrf2、GCLC、NQO1和HO-1蛋白表达水平呈剂量依赖性升高（P<0.05或P<0.01）；NLRP3炎症小体相关蛋白（NLRP3、Caspase1、GSDMD和IL-18）表达水平呈剂量依赖性降低（P<0.05或P<0.01）。雪莲果提取物对CCl4所致的大鼠急性肝损伤具有保护作用，该作用可能与调节Nrf2/HO-1通路改善氧化应激，降低脂质过氧化，清除大鼠体内自由基，抑制NLRP3炎症小体的功能，减少炎症因子的合成与释放以及降低炎症反应有关。

关键词：雪莲果提取物；急性肝损伤；Nrf2/HO-1通路；NLRP3炎症小体；氧化应激

中图分类号：R287      文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.010

Effects of Extract of Yacon on Nrf2/HO-1/NLRP3 Pathway on Acute Liver Injury in Rats

CHENG Shunzhia， FENG Lingb， YANG Qib， ZHANG Ziyub， WU Zhenglib， ZHANG Yongqina*

（Guizhou University of Traditional Chinese Medicine  a. Department of Basic Medicine; b. Department of Pharmacy， Guiyang 550025， China）

Abstract： Based on Nrf2/HO-1/NLRP3 pathway， the protective effects and mechanism of yacon extract on acute liver injury （ALI） induced by carbon tetrachloride （CCl4） in rats were investigated. Forty-eight healthy male SD rats were randomly divided into 6 groups： control group， model group， low， medium and high dose group and silymarin positive group， in which ALI model was established with CCl4 and the rats were sacrificed for sampling， and the serum and liver biochemical indexes of rats were detected. HE staining was used to observe the histopathological changes of liver in each group， and ELISA was used to detect the expression levels of inflammatory cytokines IL-6， TNF-α and IL-1β in serum of rats. The relative expression of Nrf2/HO-1/NLRP3 pathway related proteins in rat liver was determined by Western blot. The results showed that compared with normal control group， the expression levels of AST， ALT， ALP， γ-GT， MDA， IL-6 and TNF-α in serum of rats in model group significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， while the expression levels of SOD， CAT， and GSH in liver tissue were significantly decreased （P<0.05）. The pathological injury of rat liver tissue cells was obvious （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the extract of yacon could decrease the expression levels of AST， ALT， ALP， γ-GT， IL-6 and TNF-α in serum in a dose-dependent manner （P<0.05 or P<0.01）， which increase the expression levels of SOD， CAT and GSH and decrease the expression levels of MDA in liver tissue （P<0.05）. The degree of liver tissue lesions in rats was significantly improved， which the degree of liver cell necrosis and swelling was significantly reduced， and the inflammatory cell infiltration was significantly improved. Silymarin positive group significantly improved rat liver injury （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the protein expression levels of Nrf2， GCLC， NQO1 and HO-1 in the extract group and positive control group dose-dependenty increased （P<0.05 or P<0.01）. The expression levels of NLRP3 inflammator-related proteins （NLRP3， Caspase1， GSDMD and IL-18） were reduced in a dose-dependent manner （P<0.05 or P<0.01）. Yacon extracts have a protective effect on acute liver injury in rats caused by CCl4， in which the effect may be related to regulating Nrf2/HO-1 pathway to improve oxidative stress， reducing lipid peroxidation， removing free radicals in mice， inhibiting inflammatory corpuscle NLRP3 function， reducing the synthesis and release of inflammatory factors and reducing inflammation.

Key words： yacon extract; acute liver injury; Nrf2/HO-1 pathway; NLRP3 inflammasome; oxidative stress

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 272-281）

急性肝损伤（acute liver iniury，ALI）主要表现为代谢障碍、内环境稳态失衡以及肝脏功能的丧失等症状，轻度的急性肝损伤可逐渐自愈或转变为慢性肝损伤，进而引发肝纤维化、肝硬化或者肝癌，而重度的急性损伤可进展成为具有极高死亡率的急性肝衰竭。对于急性肝损伤，现阶段除肝移植之外尚无有效的治疗方法［1］。因此，寻找安全药效的食品或药物对于早期治疗或干预急性肝损伤，以及干预急性肝损伤的发生具有重要的意义。四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）是经典的诱导化学性急性肝损伤动物模型的外源性化合物，常用于研究保肝药的药效和分子作用机制［2］。目前，能够治疗化学性诱导的急性肝损伤药物远不能满足市场需求，研发天然植物药物或药食同源食物来防治急性肝损伤对于保护易感人群免受化学毒物的伤害至关重要。雪莲果（Smallanthus sonchifolius）又名亚贡，属菊科，葵花属植物，其形状像红薯，是一种菊科多年生草本植物。目前从雪莲果中分离出的化学成分达140种，主要有绿原酸（chlorogenic acid）、黄酮（flavonoids）、倍半萜内酯（sesquiterpene lactone）、低聚果糖（fructooligosaccharides）、脂肪酸（fatty acid）等成分，此外还有甾醇（sterol）、二萜（diterpenoids）、对羟基苯乙酮（p-hydroxyacetophenone）衍生物以及辛酮糖酸（octulosonic acid）衍生物类等物质，可以帮助消化，增强胃动力，排毒通便，养颜美容，此外还具有降血糖、保肝利胆、降血脂等药理作用［3-4］。大量的研究表明，肝损伤与氧化应激有着密切的关系，核转录相关因子2 （nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）属于碱性亮氨酸拉链转录因子家族，控制着II期解毒抗氧化酶的转录，如血红素加氧酶-1 （heme oxygenase 1，HO-1）、谷氨酸半胱氨酸连接酶（glutamate cysteine ligase catalytic，GCLC）和醌氧化还原酶-1 （quinone oxidoreductase 1，NQO1）等的表达，缺乏Nrf2的动物抗氧化防御能力低，极易受到氧化应激引起的各种损伤［5-6］。大量研究表明，一些草药和膳食中的多酚可以通过激活Nrf2信号通路來保护肝脏免受损伤［7-8］。因此，Nrf2被认为是氧化应激的重要内源性调节因子。

近期研究表明，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 （NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）参与了炎症性肝病的发生，NLRP3炎性小体是在肝细胞和肝实质细胞中表达的细胞内多蛋白复合物，是炎症的关键调节因子，与肝脏疾病的发生密切相关［9-10］。NLRP3炎症小体是由NLRP3组成的多蛋白复合体，由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和半胱天冬酶-1前体（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1， pro-caspase-1）组成。当NLRP3炎性小体被激活时，激活的炎性小体促使ASC将pro-caspase-1切割成为具有活性的Caspase-1，而具有活性的Caspase-1将IL-1β（interleukin-1β）前体和IL-18（interleukin-18）前体变为有活性的IL-1β和IL-18，并切割GSDMD（gasdermin-D），其N端在细胞膜上成孔，导致细胞肿胀破裂，炎症因子大量释放到胞外，从而引发细胞的焦亡［11］。研究表明，在CCl4诱导的急性肝损伤中，NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表达水平上调，说明NLRP3的激活促进了Caspase-1和IL-1β，参与CCl4诱导的肝损伤［12］。因此，抑制该信号通路的传导可以有效地抑制肝损伤的进程，对肝脏疾病治疗有非凡的意义。水飞蓟素是从水飞蓟果中提取的一种活性素，有清除活性氧、对抗脂质过氧化、促进肝细胞修复和再生等功能，在临床上常被用于治疗急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化等疾病［13］。为了进一步明确雪莲果对急性肝损伤的保护作用及其抗氧化作用机制，本研究拟采用CCl4构建急性肝损伤动物模型，基于Nrf2/HO-1/NLRP3信号通路探讨雪莲果对CCl4致大鼠急性肝损伤的保护作用及作用机制，为研究雪莲果保肝护肝的作用机理提供理论基础，为进一步开发雪莲果相关产品提供试验依据与参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

健康SPF级SD（Sprague-Dawley）雄性大鼠48只，体重（250±20）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司。试验动物使用许可证：SCXK（湘）2019-0013。大鼠保持在一个12 h光/12 h暗的循环中，温度和湿度适中，允许自由获得食物和水。动物饲养和试验设计均遵循国家医学试验动物管理实施细则，所有动物处理均获得贵州中医药大学伦理委员会的批准。

1.1.2 药品与试剂

雪莲果茎根（yacon root）购自云南省崇明市；水飞蓟素（silymarin）购自西安天广源生物科技有限公司；CCl4购自南京化学试剂有限公司；谷丙转氨酶

（alanine，ALT）检测试剂盒（批号：20211021）、谷草转氨酶（aspartate，AST）检测试剂盒（批号：20211020）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）检测试剂盒（批号：20211021）、γ-谷氨酰基转移酶（gamma-glutamic acyltransferase，γ-GT）检测试剂盒（批号：20211022）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（批号：20210525）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒（批号：20210325）、过氧化氢酶（catalase，CAT）检测试剂盒（批号：20211228）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（批号：20211225）均购自南京建成生物工程研究所。苏木素-伊红（HE）染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司（批号：20201104）；TNF-α（tumor necrosis factor-α）、IL-6（interleukin-6）和IL-1β ELISA Kit购自上海酶联免疫生物科技有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（批号：20210929）；抗体和显色液购自上海生工生物股份有限公司。

1.1.3 试验仪器

仪器1510全自动酶标仪购自赛默飞世尔科技有限公司； HH-W420恒温箱购自江苏金坛亿通电子有限公司；MR2245普通切片机购自德国莱卡；KD-BM组织包埋机购自浙江金华科迪；Nikon DS-U3成像系统购自日本Nikon公司。

1.2 试验方法

1.2.1 雪莲果提取物的制备

称取若干去皮后的雪莲果根茎，加入8～10倍蒸馏水，煎煮2次，加80%乙醇沉淀过夜，过滤、蒸馏和干燥后得到雪蓮果提取物，取该提取物加生理盐水配成原药为1 g/mL的药液。

1.2.2 动物试验分组

将48只雄性SD大鼠随机分为6组，每组8只，分别是对照组、模型组、雪莲果低剂量组［10 g/（kg·d–1）］、雪莲果中剂量组［20 g/（kg·d–1）］、雪莲果高剂量组［40 g/（kg·d–1）］和水飞蓟素阳性组［200 mg/（kg·d–1）］。除正常对照组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水外，其余各组均灌胃相应剂量雪莲果提取物，水飞蓟素阳性组灌胃相应剂量的水飞蓟素溶液（200 mg/kg），每日1次，连续给药1周。末次给药结束2 h后，除正常对照组大鼠腹腔注射等体积橄榄油外，其余组大鼠均一次性腹腔注射50% CCl4的橄榄油溶液（10 mL/kg）建立大鼠急性肝损伤模型。

1.2.3 标本采集

试验动物在注射CCl4 24 h后左右采血，采血前隔夜禁食不禁水，秤重，予水合氯醛（10%）腹腔注射麻醉，由腹正中线切皮，进入腹腔分离腹主动脉，经腹主动脉采血。将获得的各组大鼠血液室温静置2 h后，4℃、3 000 r/min离心15 min，得到各组大鼠血清，收集血清，分装后-80℃保存备用。在充分暴露游离肝脏后，在肝脏右叶中部距边缘5 mm处用剪刀取肝组织小块，一部分用液氮速冻在-80℃保存备用，另外一部分固定在10%多聚甲醛中用于相关指标的检测。

1.3 样品生化指标检测

将获得的各组大鼠血清，按照试剂盒说明书要求严格检测各组血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的酶活性。取大鼠肝脏组织0.1g左右，加入9倍体积的预冷生理盐水，破碎混匀制成10%肝组织匀浆液，严格按照试剂盒说明书步骤检测肝脏组织中SOD和CAT的酶活性以及GSH和MDA的含量。利用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测各组大鼠血清中炎症因子TNF-α、 IL-6和IL-1β 的表达水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，获得各组血清中TNF-α、IL-6和IL-1β 的含量。

1.4 HE染色

各组切取相同部位肝脏组织，用生理盐水清洗后，10%低聚甲醛固定24 h；不同浓度乙醇脱水；二甲苯透明后进行石蜡包埋，将包埋好的样品置于切片机上，并设置切片厚度为5 ?m进行切片；待切片完全展开整齐无褶皱后，用载玻片捞起放于铁制载玻片架中。烘干后进行脱蜡和复水：1）依次将切片放入二甲苯Ⅰ中30 min→二甲苯Ⅱ中30 min→无水乙醇Ⅰ中5 min→无水乙醇Ⅱ中5 min→75%乙醇中5 min，自来水冲洗；2）苏木素染色10 min，盐酸水溶液分化30 s，氨水溶液返蓝，流水冲洗；3）切片依次入85%和95%乙醇中梯度脱水，入伊红染液中染色5 min；4）切片依次放入无水乙醇Ⅰ中10 min→无水乙醇Ⅱ中10 min→二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各5 min使之透明，中性树胶封片；在普通光学显微镜下观察组织病理学改变，进行病理学分析。

1.5 蛋白印迹法（Western blot）

分别取各组的肝脏组织约100 mg，加入1 mL蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，裂解离心吸取上清液。采用蛋白定量（bicinchoninic acid，BCA）试剂检测方法测定总蛋白含量。取蛋白样品加热并混合上样缓冲液，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行电泳，聚偏氟乙烯转膜，用5% BSA在室温下孵育1 h，加入相应Nrf2（#D121053）、HO-1（#D220756）、GCLC（#D222177）、GSDMD（#17535-1-AP）、Caspase-1（#D120080）、NQO1（#D120134）、NLRP3（#D120168）、IL-18（#D220073）和β-actin（#20536-1-AP）的一抗，4℃孵育过夜。洗涤后加入山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）室温孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液显影。应用凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，得出灰度值。检测目的蛋白表达水平，以β-actin为内参照进行半定量分析。

1.6 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学处理，试验均重复3次，计量资料采用平均值±标准差（x±s）的形式表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 雪莲果对CCl4诱导肝损伤大鼠血清生物

标志物的影响

血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的水平是评估肝损伤严重程度的标志。由图1可见，在CCl4诱导的模型大鼠中，模型组与正常对照组比较，血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的酶活性水平显著升高（P<0.05）。与模型组相比，雪莲果高中剂量组血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的酶活性水平均显著降低且差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。阳性对照组与模型组相比，血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的酶活性水平均显著降低且差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。

2.2 雪莲果提取物对各组大鼠肝脏抗氧化因子

及MDA水平的影响

细胞中SOD、CAT的酶活性及GSH的含量能够反应细胞的抗氧化能力。试验结果显示，模型组与对照组相比，大鼠肝脏中SOD、CAT活性及GSH、MDA含量均显著改变且差异具有统计学意义（P<0.05）。雪莲果组与模型组相比，大鼠肝脏中SOD、CAT的活性均显著升高，GSH的含量升高而MDA的含量降低，且呈剂量依赖性变化，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；阳性对照组与模型组相比，大鼠肝脏中SOD、CAT的活性均显著升高，GSH的含量升高而MDA的含量降低，且呈剂量依赖性变化，差异具有统计学意义（P<0.01），具体结果见图2。

2.3 各组大鼠肝损伤的组织病理学观察

通过HE染色观察各组大鼠肝脏组织病理学变化情况，结果发现，正常组大鼠肝脏组织未见异常，组织细胞分布均匀，肝索清晰，没有细胞坏死、脂肪变性或炎症细胞浸润的出现。如图3所示，CCl4诱导的模型组大鼠肝脏与对照组相比，模型组大鼠肝细胞呈紧张性脂肪变性，可见不同大小的脂肪液泡弥漫性分布，胞浆、肝细胞区可见大面积局灶性坏死并伴炎症细胞浸润增生。雪莲果高剂量组和阳性对照组，与模型组比较，大鼠肝脏中的坏死性细胞明顯减少，炎症细胞浸润明显减少，与模型组比较细胞完整性得到有明显改善（P<0.05）。雪莲果中剂量组与模型组比较，坏死性细胞明显减少，炎症细胞浸润相对减少，细胞坏死情况得到相对改善（P<0.05）。雪莲果低剂量组与模型组比较，坏死性细胞相对减少，炎症细胞浸润相对减少，但差异并不显著（P>0.05）。

2.4 雪莲果提取物对各组大鼠肝脏TNF-α、IL-6

及IL-1β水平的影响

血清中TNF-α、IL-6以及IL-1β均作为炎症因子反映肝损伤程度和机体炎症水平。如图4所示，通过ELISA方法检测各组大鼠血清炎症因子水平，与正常对照组相比，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平显著升高（P<0.05）。与模型组相比，雪莲果高剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低（P<0.05），阳性对照组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低（P<0.05），雪莲果中低剂量组与模型组比较大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β差异不显著（P>0.05）。

2.5 雪莲果提取物对各组大鼠肝脏组织中Nrf2

相关基因蛋白水平的影响

利用Western blot技术检测各组大鼠肝脏中Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1蛋白的表达水平。如图5所示，与正常对照组相比，模型组Nrf2蛋白的表达水平显著降低（P<0.05），而HO-1和NQO1蛋白的表达水平相对升高（P>0.05）。雪莲果组与模型组相比，肝脏中Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1蛋白的表达水平呈剂量依赖性升高（P<0.05），阳性对照组与模型组比较，Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1蛋白的表达水平均显著升高（P<0.05）。

2.6 雪莲果提取物对各组大鼠肝脏组织中NLRP3相关基因蛋白水平的影响

利用Western blot技术检测各组大鼠肝脏中NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-18蛋白的表达水平。如图6所示，与正常对照组相比，模型组NLRP3、GSDMD、IL-18蛋白的表达水平显著升高（P<0.05或P<0.01）。雪莲果组与模型组相比，肝脏中NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-18蛋白的表达水平呈剂量依赖性降低（P<0.05或P<0.01），阳性对照组与模型组比较，NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-18蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）。

3 讨论

在本研究中，我们发现雪莲果提取物显著改善了CCl4诱导的大鼠急性肝损伤，能够降低肝损伤大鼠血清中ALT、AST、ALP和γ-GT的活性，降低CCl4诱导的大鼠肝脏组织中MDA的表达水平，提高肝脏组织中SOD、CAT和GSH的表达水平。同时，雪莲果提取物能够有效降低大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平，提高NRF2/HO-1信号通路关键蛋白的表达，同时能够抑制NLRP3炎症小体的激活来保护CCl4诱导的大鼠急性肝损伤。肝损伤会导致各种肝脏疾病，寻找安全有效的药物或药食同源的食品对治疗和预防肝损伤具有重要意义。CCl4诱导的急性肝损伤模型是研究保肝护肝类药物的经典模型之一，其作用机制为CCl4进入机体后，最先进入肝脏进行代谢，在肝细胞中被细胞色素P450分解，产生三氯甲基等氧自由基，破坏细胞内微环境稳态［14］。氧自由基会促进细胞膜进行脂质过氧化反应，破坏肝细胞膜的完整性，进而增加细胞膜的通透性，导致细胞内容物外流，致使细胞坏死肿胀［15］。肝细胞内容物如ALT和AST持续外流进入血液当中，引起血清中ALT和AST活性升高。因此，血清中ALT和AST的水平也反映了肝脏受损的严重程度［16］。此外，脂质过氧化会加大肝细胞的破坏导致ALP和γ-GT持续外流，引起血清中ALP和γ-GT水平显著升高，而血清中ALP水平不仅是肝细胞受损的程度指标，也是临床上检测肝脏疾病的主要指标。当肝脏受损时会造成γ-GT排泄受阻，随胆汁反流入血引起血清中γ-GT异常升高［17］。在脂质过氧化过程中产生大量的MDA，其能够加剧细胞膜的受损，因而MDA也可作为组织氧化应激情况和过氧化程度的重要生物指标之一［18］。SOD和CAT均能消除或减轻细胞氧化损伤，能够清除细胞内氧自由基，当细胞内过氧化水平升高时，SOD和CAT水平也会相应上升来抵抗外界的过氧化，因此，SOD和CAT是机体内重要的抗氧化物质［19］。还原性GSH具有较强的还原性，能中和细胞当中的氧化物质，保护细胞膜的完整性，促进肝脏排泄和解毒，当细胞中氧化程度过高时会一定程度上消耗GSH，导致其含量较低［20］。本研究利用雪莲果处理CCl4诱导的大鼠肝损伤模型，结果显示，雪莲果能够显著降低CCl4诱导的大鼠血清中ALT、AST、ALP和γ-GT的水平（P<0.05），这表明雪莲果能够在一定程度上改善CCl4引起的肝损伤。此外，本研究发现雪莲果能够降低CCl4诱导的大鼠肝脏组织中SOD、CAT和MDA的表达水平（P<0.05），同时升高肝脏组织中GSH的表达水平（P<0.05），这说明雪莲具有一定的抗氧化作用，可能通过调控氧化应激作用改善CCl4引起的肝损伤。

雪莲果中主要含有绿原酸、黄酮和低聚果糖等成分，具有抗氧化、抗炎、降血糖、抑菌、抗癌作用［21］。已有研究表明，绿原酸具有抗氧化作用，可以通过促进Nrf2入核，增强肝组织中HO-1、NQO1和GCLC的表达，进而改善肝损伤［22-23］。为了进一步明确雪莲果改善CCl4诱导大鼠急性肝损伤的作用机制，本试验检测了各组大鼠血清炎症因子表达水平，结果显示，雪莲果提取物显著减少血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症细胞因子的表达水平。此外，我们检测了大鼠肝脏组织中重要抗氧化应激的Nrf2/HO-1信号通路相关基因的表达水平，结果显示，雪莲果提取物能够显著提高Nrf2、HO-1、NQO1和GCLC的表达水平。因此，本试验结果显示，雪莲果可能通过激活Nrf2基因，促进抗氧化因子的表达，增强CCl4诱导急性肝损伤大鼠抗氧化能力，进而缓解急性肝损伤。由此可见，雪莲果改善肝损伤的作用机制可能与其含有的有效成分相关，复杂的成分为其改善肝损伤奠定了基础。

NLRP3炎症小体是由NLRP3、ASC及pro-caspase-1组成的多蛋白复合物，当NLRP3炎症小体被激活后，前体Caspase-1被切割成具有活性的Caspase-1，Caspase-1切割前体IL-1β（pro-IL-1β），产生具有炎性作用的IL-1β，参与炎症反应［24］。研究表明，CCl4诱导的急性肝损伤肝组织中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表达上调，这表明NLRP3活化促进Caspase-1、IL-1β参与了CCl4诱导的肝脏损伤，进而抑制Caspase-1、IL-1β等表达并显著减轻肝脏损伤［25］。研究表明，绿原酸能够抑制NLRP3炎症小体激活来保护急性肾损伤［26］。此外，绿原酸可以通过Nrf2/NLRP3信号减弱LPS诱导的人牙龈成纤维细胞的炎症［27］。本研究结果表明，雪莲果提取物能够抑制NLRP3炎症小体激活，降低NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18和IL-1β等蛋白的表达水平，从而有效改善CCl4诱导的大鼠急性肝损伤。

综上所述，本研究初步确定雪莲果提取物对CCl4诱导的大鼠急性肝损伤具有一定的保护作用，其主要通过降低脂质过氧化，清除大鼠体内自由基，保护大鼠肝细胞的完整性，同时激活Nrf2的表达，抑制NLRP3炎症小体激活，降低炎症反应，减轻大鼠肝细胞损伤来保护大鼠肝脏。本研究明确了Nrf2/HO-1/NLRP3通路在雪莲果提取物治疗CCl4诱导的急性肝损伤的作用机制，为雪莲果的临床应用和市场推广提供了理论基础。

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