白藜芦醇联合姜黄素腹腔预注射小鼠脓毒症诱发过程中的肺损伤情况观察

张杰，刘自新，贾炳学，张爱新，张卓

北京市平谷区医院急诊科，北京 101200

脓毒症是一种由病原体严重感染引起的过度免疫反应性疾病，主要表现为不受控制的炎症反应，最终导致多器官功能衰竭。临床诊疗过程中25%～50%的脓毒症患者可发生急性肺损伤（acute lung injury，ALI），治疗后病死率高达 40%［1］。目前脓毒症ALI尚无特异性治疗方法，临床治疗策略主要包括高流量鼻导管和无创通气、神经肌肉阻滞、体外膜肺氧合及支持治疗等。最近研究［2］表明，早期应用抗炎药物是一种有效的脓毒症ALI治疗策略。白藜芦醇是一种多酚类化合物，主要存在于葡萄、桑椹、花生及大黄等植物中，在预防和治疗一些慢性疾病（如糖尿病、肥胖症、心血管疾病及神经退行性疾病）中发挥重要作用［3］。姜黄素是从姜黄中提取的黄色着色剂，是一种多效性分子，可与炎症分子靶标相互作用，在炎症性肠病、关节炎、胰腺炎以及慢性前葡萄膜炎等炎症性疾病中发挥治疗作用［4］。最新研究［5］发现，藜芦醇和姜黄素联用可提高仔猪小肠的消化酶活性及胰腺抗氧化能力，缓解应激导致的炎症性损伤。细胞实验［6］证实，白藜芦醇联合姜黄素可有效降低癌细胞存活率，抗肿瘤效应较好。因此，白藜芦醇和姜黄素具有良好的联合用药基础。据文献［7-8］报道，白藜芦醇和姜黄素腹腔注射均能改善脓毒症小鼠的肺损伤程度，但治疗效果并不理想。白藜芦醇联合姜黄素对脓毒症小鼠ALI的疗效是否优于单独用药目前尚不清楚。2020年3月—2022年10月，我们观察了白藜芦醇联合姜黄素腹腔预注射小鼠脓毒症诱发过程中的肺损伤情况，并探讨其作用机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 90只8～10周龄雄性C57BL/6J小鼠（体质量25～30 g）购自北京百奥思科生物医学技术有限公司。小鼠实行分笼饲养，每笼2～3只，环境为SPF级，温度21 ℃～23 ℃，湿度30%～70%，给予12 h光照/黑暗周期，并提供充足的饲料与饮用水。所有涉及动物的实验均经北京市平谷区医院医学伦理委员会审批（No. 20200014），并且符合国际实验动物实验和使用指南（1996年修订版）。白藜芦醇与姜黄素购自南京合谷生命生物科技有限公司，小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6以及IL-10酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自美国BD公司，小鼠Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-related X protein，Bax）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）以及激活型多聚ADP核糖聚合酶1（cleaved poly ADP-ribose polymerase 1，cleaved PARP）抗体购自美国CST公司，二抗购自北京百奥莱博科技公司，荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promega公司，核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）萤火虫报告载体与海肾报告载体购自南通百奥生物技术有限公司，苏木精-伊红（HE）与多聚甲醛购自北京天根生化科技有限公司，杜尔贝科改良鹰培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）以及 lipofectamine 2000试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 小鼠分组及白藜芦醇联合姜黄素预处理方法 90只小鼠随机分为 1、2、3、4、5组，每组 18只。1、2、3组分别腹腔注射100 mg/kg姜黄素、40 mg/kg白藜芦醇、100 mg/kg姜黄素 + 40 mg/kg白藜芦醇，然后用盲肠结扎穿刺法（cecal ligation and puncture，CLP）建立脓毒症模型；4组腹腔注射等量无菌0.9%生理盐水后用CLP建立脓毒症模型；5组仅腹腔注射等量的无菌0.9%生理盐水。参照文献［9］采用CLP建立脓毒症小鼠模型：首先腹腔注射戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉小鼠，仰卧位固定。腹部做0.4 cm纵向中线切口暴露盲肠。使用3-0医用丝线在距尖端1 cm处结扎盲肠，并在距离结扎处0.5 处用20号针头穿孔1次。按压盲肠挤出少量粪便后将肠管重新放置于腹腔内。依次关闭腹部肌肉组织、腹膜和皮肤。术后立即给予小鼠皮下注射生理盐水进行液体复苏，自由饮水和进食。

1.3 各组小鼠存活情况观察 术后常规监测小鼠各项生命活动，记录第1～5天小鼠存活情况。

1.4 各组小鼠肺组织损伤情况观察 第5天处死各组小鼠，常规收集双侧肺组织，左侧肺组织立即称重，80 ℃烘箱干燥24 h后称重，计算肺组织湿/干重（wet weight/dry weight，W/D）。右侧肺组织取部分4 ℃固定于4%多聚甲醛，HE染色后于100倍放大镜下随机选择6个视野，参照文献［10］进行肺组织损伤评分。评分标准：①肺泡腔中的中性粒细胞聚集（A）情况，0视野可见计0分、1～5个视野计1分、＞5个视野计2分；②间质中的中性粒细胞聚集（B）情况，0视野可见计0分、1～5个视野计1分、＞5个视野计2分；③透明膜形成（C）情况，0视野可见计0分、1个视野计1分、＞1个视野计2分；④肺泡腔中存在蛋白质碎片（D）情况，0视野可见计0分、1个视野计1分、＞1个视野计2分；⑤肺泡间隔增厚（E）情况，＜2个视野计0分、2～4个视野计1分、＞4个视野计2分。肺组织损伤评分=｛（20×A） + （14×B） + （7×C）+ （7×D） + （2×E）｝/（视野数×100）。重复计算3次，取平均值。

1.5 各组小鼠肺组织中炎症因子的表达检测 采用ELISA法检测促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）与抗炎因子（IL-10）的表达情况。取各组小鼠肺组织，充分研磨、裂解，4 ℃下13 000 g离心，取上清液。将上清液加入反应孔中，随后依次加入加酶标抗体和底物，所有操作均严格按照试剂说明书进行，用多功能酶标仪分析各组450 nm波长下的吸光度值，利用标准品绘制标准曲线，测算肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10相对表达量。重复计算3次，取平均值。

1.5 各组小鼠肺组织中细胞凋亡相关蛋白的表达检测 采用WESTERN Blotting法检测促凋亡蛋白（Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP）和抗凋亡蛋白（Bcl-2）的表达情况。取各组小鼠肺组织，提取肺组织总蛋白并测定浓度。制备12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，依次经过上样、电泳以及转膜处理后，37 ℃封闭2 h。然后将膜在4 ℃下与Bax（1：1 000稀释）、Bcl-2（1：1 000稀释）、cleaved caspase-3（1：750稀释）以及cleaved PARP（1：2 000稀释）抗体孵育过夜，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体作为内参对照。增强化学发光液进行显色处理，并使用Image-Pro Plus 6.0版软件测算Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白相对表达量，目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值为目的蛋白相对表达量。重复计算3次，取平均值。

1.6 各组小鼠肺组织中NF-κB通路活性检测 采用荧光素酶报告基因测算NF-κB通路的激活情况。取各组小鼠肺组织，分离小鼠原代肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs），DMEM培养基 + 10% FBS于37 ℃ 5% CO2下培养。后采用Lipofectamine 2000试剂共转染NF-κB萤火虫报告载体与海肾报告载体至PMVECs细胞。24 h后收集细胞并裂解获取上清，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组中萤火虫荧光素酶值与海肾荧光素酶值，计算NF-κB通路相对活性，NF-κB通路活性=萤火虫荧光素酶值/海肾荧光素酶值×100%。重复计算3次，取平均值。

1.7 统计学方法 采用SPSS28.0统计软件进行数据处理。P-P图检验数据的正态性，正态分布的计量资料以表示，统计学比较采用单因素方差分析与Mann-Whitney检验；计数资料用%表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 第5天时各组小鼠存活情况比较 第5天时1、2、3、4、5组小鼠分别存活4、5、13、1、18只。与5组比较，第5天4组小鼠存活率低（P均＜0.05）；与1、2、4组比较，第5天3组小鼠存活率高（P均＜0.05）。

2.2 各组小鼠肺组织W/D、肺组织损伤评分比较 各组小鼠肺组织W/D、损伤评分见表1。与5组比较，4组小鼠肺组织W/D与损伤评分高（P均＜0.05）。与4组比较，1、2组小鼠肺组织W/D与损伤评分低（P均＜0.05）。与2组比较，1组小鼠肺组织W/D低（P＜0.05）。与1、2、4组比较，3组小鼠肺组织W/D和损伤评分低（P均＜0.05）。

表1 各组小鼠肺组织W/D及肺组织损伤评分（）

表1 各组小鼠肺组织W/D及肺组织损伤评分（）

组别1组2组3组4组5组W/D 6.07 ± 0.30 6.44 ± 0.35 4.79 ± 0.41 8.21 ± 0.49 3.62 ± 0.28损伤评分（分）0.11 ± 0.03 0.10 ± 0.05 0.06 ± 0.02 0.18 ± 0.06-

2.3 各组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10浓度比较 各组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β及IL-6、IL-10浓度见表2。与5组比较，4组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10浓度高（P均＜0.05）。与4组比较，1、2组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6浓度低，IL-10浓度高（P均＜0.05）。与2组比较，1组小鼠肺组织中IL-10浓度高（P＜0.05）。与1、2、4组比较，3组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6浓度低，IL-10浓度高（P均＜0.05）。

表2 各组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10浓度（pg/mL，）

表2 各组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10浓度（pg/mL，）

组别1组2组3组4组5组TNF-α 248.77 ± 20.90 249.14 ± 24.51 112.49 ± 13.08 324.95 ± 27.24 42.56 ± 7.65 IL-1β 34.13 ± 3.77 37.22 ± 4.02 26.92 ± 1.50 51.95 ± 5.43 15.38 ± 1.98 IL-6 157.70 ± 8.81 152.14 ± 9.67 94.98 ± 6.46 209.08 ± 17.85 67.31 ± 8.22 IL-10 47.12 ± 6.15 42.60 ± 3.75 59.22 ± 4.60 34.53 ± 2.91 26.41 ± 3.06

2.4 各组小鼠肺组织中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及cleaved PARP蛋白相对表达量比较 各组小鼠肺组织中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及cleaved PARP蛋白相对表达量见表3。与5组比较，4组小鼠肺组织中Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白相对表达量高，Bcl-2蛋白相对表达量低（P均＜0.05）。与4组比较，1、2组小鼠肺组织中Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白相对表达量低，Bcl-2蛋白相对表达量高（P均＜0.05）。与2组比较，1组小鼠肺组织中Bax、cleaved caspase-3蛋白相对表达量低，Bcl-2蛋白相对表达量高（P＜0.05）。与1、2、4组比较，3组小鼠小鼠肺组织中Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白相对表达量低，Bcl-2蛋白相对表达量高（P均＜0.05）。

表3 各组小鼠肺组织中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白相对表达量（）

表3 各组小鼠肺组织中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白相对表达量（）

组别1组2组3组4组5组Bcl-2 0.11 ± 0.05 0.06 ± 0.03 0.19 ± 0.07 0.02 ± 0.03 1.00 ± 0.11 Bax 7.74 ± 0.39 9.28 ± 0.45 2.50 ± 0.13 14.12 ± 0.58 1.00 ± 0.06 cleaved caspase-3 2.26 ± 0.15 5.77 ± 0.40 1.18 ± 0.14 7.53 ± 0.67 1.00 ± 0.08 cleaved PARP 2.86 ± 0.21 2.80 ± 0.17 0.07 ± 0.02 6.19 ± 0.33 1.00 ± 0.06

2.5 各组小鼠肺组织中NF-κB通路活性比较 1、2、3、4、5组小鼠肺组织中NF-κB通路相对活性分别为250.09% ± 16.35%、 272.42% ± 16.88%、164.31% ±15.105%、406.95% ± 24.18%、127.68% ± 13.59%。与5组比较，4组小鼠肺组织中NF-κB通路相对活性高（P＜0.05）；与4组比较，1、2组小鼠肺组织中NF-κB通路相对活性低（P均＜0.05）；与2组比较，1组小鼠肺组织中NF-κB通路相对活性低（P＜0.05）；与1、2、4组比较，3组小鼠肺组织中NF-κB通路相对活性低（P均＜0.05）。

3 讨论

脓毒症是临床常见危重症疾病之一，其发病率呈逐年上升趋势，病死率居高不下。脓毒症的发病机制十分复杂，涉及全身炎症网络效应、基因多态性、免疫功能障碍、凝血障碍、组织损伤以及宿主对不同病原微生物及其毒素的异常反应等［11］。ALI是脓毒症相关并发症中最常见也是预后较差的一种并发症。与其他因素引发的ALI相比，脓毒症ALI 患者多器官功能障碍、疾病严重程度和院内病死率更高。近年来研究［12-13］发现，脓毒症ALI发生与炎症因子的持续过度激活和失控相关。因此，治疗脓毒症ALI的关键点在于及时阻断炎症反应的发生。白藜芦醇和姜黄素在多种疾病治疗中表现出抗炎作用，表明二者具有治疗脓毒症ALI的潜力。本研究发现，白藜芦醇联合姜黄素腹腔预注射小鼠脓毒症可以有效减轻肺损伤程度。

利用可靠、稳定的动物模型有助于明确脓毒症ALI发病机制、发掘潜在治疗靶点、检测新研发药物安全性以及治疗效果。与脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）腹腔注射建模相比，CLP建模可以反映人类脓毒症的众多特征，被认为是脓毒症的高度标准化模型之一，当前应用极为广泛［14］。本研究中我们采用CLP建立脓毒症小鼠模型，并发现4组小鼠存活率较5组显著降低，HE染色后发现4组小鼠肺组织W/D比值与损伤评分较5组显著增加。ELISA法检测发现4组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10浓度较5组显著升高。同时WESTERN blotting法检测发现4组小鼠肺组织中Bax、cleaved caspase-3及cleaved PARP蛋白表达较5组显著提高。上述结果充分证实4组小鼠脓毒症建模成功。

抗氧化、抗衰老、抗癌、抗糖尿病、心脏保护及神经保护作用使得白藜芦醇成为研究最多的天然多酚之一。此外，白藜芦醇通过调节免疫细胞活性与促炎细胞因子的合成抑制炎症反应［15］。近年研究发现，白藜芦醇对ALI具有治疗作用。GUO等［16］发现白藜芦醇通过调节常规树突状细胞的成熟和功能可以减轻LPS诱导的小鼠ALI。JIANG等［17］揭示白藜芦醇通过降低长链非编码RNA XLOC_014869表达可以改善LPS诱导的大鼠ALI并抑制细胞凋亡。姜黄素是姜黄植物的活性成分，为抗氧化剂、抗炎剂和抗癌剂受到了极大的关注。姜黄素对ALI也具有治疗作用，能够改善肺组织损伤。SHAIKH等［18］通过蛋白质组学方法证实姜黄素通过抗氧化和抗纤维化活性对ALI发挥保护作用。LIANG等［19］报道姜黄素通过miR-21/PTEN/NF-kappaB信号通路保护急性肺栓塞大鼠的炎症和肺损伤。本研究中2组小鼠第2 、3 天存活率较4组升高，1组小鼠第2 天存活率较4组升高，1、2组小鼠肺组织W/D比值与损伤评分较4组降低，表明白藜芦醇与姜黄素腹腔预注射均可以改善脓毒症ALI。3组小鼠第1～4 天存活率较1、2组升高，肺组织W/D和损伤评分较1、2组降低，表明白藜芦醇联合姜黄素腹腔预注射对脓毒症ALI的改善效果优于二者单独用药。

脓毒症ALI进展过程中炎症反应和细胞凋亡的上调导致肺泡上皮细胞破坏、上皮通透性增加和肺水肿形成。肺组织中促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β及IL-6水平持续升高，导致患者病死率成比例上升［20］。还有一些研究［21］表明，促凋亡蛋白如 Bax、cleaved caspase-3及cleaved PARP可以加剧肺泡上皮细胞凋亡和损伤，进而提高患者病死率。上述研究表明，抑制促炎细胞因子与促凋亡蛋白表达对于改善脓毒症ALI至关重要。本研究中1、2组肺组织中促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6浓度与促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3及cleaved PARP蛋白表达较4组降低，而抗炎因子IL-10浓度与抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达较4组升高，表明藜芦醇和姜黄素具有抗炎和抗凋亡作用。此外，3组中上述蛋白与炎症因子的变化程度较1、2组提高，表明白藜芦醇联合姜黄素腹腔预注射对脓毒症ALI中炎症反应与细胞凋亡的抑制作用优于藜二者单独用药。

NF-κB是炎症过程的中心介质，也是先天性和适应性免疫反应的关键参与者，可以被IL-1β和TNF-α激活［22］。NF-κB作为调控炎症反应的转录因子，可调控各种促炎基因的翻译表达。NF-κB通路激活在脓毒症引起的器官损伤的发病机制中起关键作用。ALI小鼠肺组织中NF-κB通路存在过度激活现象，抑制NF-κB表达可以降低炎症水平并改善肺组织病理损伤。本研究中4组小鼠PMVECs中NF-κB通路活性较5组升高，表明脓毒症ALI中NF-κB通路被激活［23］。1、2组小鼠PMVECs中NF-κB通路活性较4组降低，表明藜芦醇和姜黄素腹腔预注射可以抑制NF-κB通路激活［24-25］。3组小鼠PMVECs中NF-κB通路活性较1、2组降低，表明白藜芦醇联合姜黄素腹腔预注射对NF-κB通路激活的抑制作用优于二者单独用药。本实验不足之处在于未能就白藜芦醇联合姜黄素对NF-κB通路靶向调节作用及其上下游基因的反馈性调节作用进行研究，拟在后续深入研究。

综上所述，白藜芦醇联合姜黄素腹腔预注射可有效减轻小鼠脓毒症诱发过程中的肺损伤程度，其效果优于二者单独用药，作用机理与其抑制炎症反应和细胞凋亡以及NF-κB通路激活有关。