葡萄籽原花青素提取物预灌胃对造影剂诱导糖尿病大鼠急性肾损伤的预防作用观察

翟志红，张海俊，黄辉，牛强

1 石河子大学医学院第一附属医院心内科，新疆石河子 832000；2 石河子大学医学院第一附属医院病理科；3 石河子大学医学院预防医学系

糖尿病是造影剂诱导急性肾损伤（contrast-induced acute kidney injury， CI-AKI）的独立危险因素［1］。氧化应激在造影剂诱导急性肾损伤的发生发展中起关键作用。研究［2］发现，核因子E2相关因子2（Nrf2）-Kelch样ECH关联蛋白1（Keap1）信号转导通路是细胞防御氧化应激的主要系统，被认为是阻断氧化应激致组织损伤的有效靶点，葡萄籽原花青素 提 取 物（grape seed proanthocyanidins extract，GSPE）是葡萄籽的主要有效活性成分，可清除自由基、抑制氧化应激损伤、修复DNA和线粒体功能受损［3-4］。本课题组前期体外细胞研究［5］发现，GSPE可通过激活Nrf2-Keap1通路蛋白表达，减轻造影剂通过氧化应激损伤导致的人肾小管上皮细胞HK-2凋亡。2021年1—7月，我们观察GSPE预灌胃对造影剂诱导糖尿病大鼠急性肾损伤的预防作用，进一步探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 鼠龄为4周的清洁级雄性SD大鼠60只，体质量90～100 g，由新疆医科大学实验动物中心提供。链脲佐菌素（STZ）（ 美国Sigma公司），碘海醇（上海通用电气药业，碘含量350 mg/ml），葡萄籽原花青素提取物（天津尖峰天然产物研究开发有限公司，纯度＞95.0%，批号：G050412），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（南京建成生物技术研究所），兔多抗 Nrf2、醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素单加氧酶-1（HO-1） 抗体、兔单抗Keap1抗体（武汉博士德生物工程有限公司），TUNEL染色试剂盒（美国R&D公司），光学显微镜及摄像系统、病理图像分析仪（日本奥林巴斯）。

1.2 动物分组及GSPE给予方法 60只SD大鼠适应性喂养1周，高脂高糖饲料喂养4周。取50只大鼠40 mg/kg剂量腹腔注射1%的STZ，造模72 h后连续3天测定大鼠尾静脉空腹血糖，以连续3次空腹血糖＞11.1 mmol/L为标准，一次性成功41只糖尿病大鼠模型。随机分为糖尿病组（DM组）8只，糖尿病 +造影剂组（CM组）9只、糖尿病 + 造影剂 + GSPE低剂量组（低剂量组）8只、糖尿病 + 造影剂 + GSPE中剂量组（中剂量组）8只、糖尿病 + 造影剂 + GSPE高剂量组（高剂量组）8只。取另10只肥胖大鼠为空白对照组（NC组），1 mL/kg腹腔注射柠檬酸缓冲液（0.1 mmol/L， pH 4.4）。NC组、DM、CM组大鼠每日用10 mL/kg生理盐水灌胃1次，第3天灌胃24 h时，NC组、DM组尾静脉注射5 mL/kg生理盐水，CM组尾静脉注射碘海醇（1.8 g I/kg）。低、中、高剂量组大鼠每日分别用50、250、500 mg/kg的GSPE灌胃1次，连续3天，第3天灌胃24 h时尾静脉注射碘海醇（1.8 g I/kg）。

1.3 各组大鼠肾功能指标检测 尾静脉注射药物48 h各组大鼠断尾采血，3 000 r/min离心10 min，取血清-80 ℃保存。采用全自动生化仪检测各组大鼠血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）。重复检测3次，取平均值。

1.4 各组大鼠肾脏组织氧化损伤指标检测 采血后处死各组大鼠，分离肾组织，用冰生理盐水洗涤干净，将肾组织置于10%中性甲醛溶液固定24 h，脱水、透明、石蜡包埋、切片，HE染色后观察肾组织病理改变。另取肾组织匀浆后采用试剂盒测定肾组织SOD、MDA。重复检测3次，取平均值。

1.5 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡检测 取肾组织，采用原位缺口末端标记法 （TUNEL）测算各组大鼠肾小管上皮细胞的凋亡指数，检测操作严格按照TUNEL试剂盒说明书进行，细胞核中有棕黄色颗粒的细胞为凋亡细胞。重复测算3次，取平均值。

1.6 各组大鼠肾组织Nrf2-Keap1通路下游关键基因关醌氧化还原酶 1（NQO1）、血红素单加氧酶-1（HO-1）、Nrf2及Keap1蛋白检测 取各组大鼠肾组织，采用WESTERN Blotting法检测各组大鼠肾组织NQO1、HO-1、Nrf2及Keap1蛋白。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行，重复检测3次，取平均值。

1.7 统计学方法 采用 SPSS21.0 统计软件进行数据分析。采用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以-表示，两组间比较应用t检验，多组比较采用单因素ANOVA方差分析，多组间应用Tukey多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清SCr、BUN水平比较 各组大鼠血清SCr、BUN水平比较见表1。

表1 各组大鼠血清SCr、BUN水平比较（-）

表1 各组大鼠血清SCr、BUN水平比较（-）

注：与NC组比较，*P＜0.05；与CM组比较，#P＜0.05；与低剂量组比较，△P＜0.05。

BUN（mmol/L）8.38 ± 1.78*#6.01 ± 1.75#△5.54 ± 0.85#△5.61 ± 0.50#△5.95 ± 1.67#△10.32 ± 2.25*△组别低剂量组中剂量组高剂量组NC组DM组CM组n 8 8 8 1 0 8 9 SCr（μmol/L）65.55 ± 2.45*#57.23 ± 6.01#△55.30 ± 2.94#△55.02 ± 2.33#△56.45 ± 3.65#△78.33 ± 6.37*△

2.2 各组大鼠肾组织匀浆SOD、MDA水平比较 各组大鼠肾组织匀浆SOD、MDA水平比较见表2。

表2 各组大鼠肾组织匀浆SOD、MDA水平比较（-x ± s）

2.3 各组大鼠肾组织病理变化 光镜下观察各组大鼠肾组织病理变化：NC组肾小球结构及形态正常，肾间质可见少许炎性细胞浸润。DM组可见部分肾小管上皮细胞肿胀，极少数肾小管上皮细胞可见空泡样变性，部分间质可见炎性细胞浸润。CM组肾小球肿胀明显，肾小囊腔变窄，肾小管上皮细胞发生重度肿胀及空泡样变性，肾间质炎性细胞浸润较DM组进一步加重，与其余5组比较，该组肾脏病理改变最为显著。与CM组比较，中高剂量组肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性及间质炎性浸润明显改善。

2.4 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数比较 低、中、高剂量组大鼠肾小管上皮细胞凋亡检数分别为53.92 ± 3.44、25.15 ± 3.33、18.15 ± 3.26，NC 组、DM 组、CM 组分别为 4.79 ± 0.84、25.37 ± 2.84、56.30 ± 4.2。与CM组比较，中、高剂量组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数小（P均＜0.05）。

2.5 各组大鼠肾组织NQO1、HO-1、Nrf2及Keap1蛋白相对表达量比较 各组大鼠肾组织NQO1、HO-1、 Nrf2及Keap1蛋白相对表达量比较见表3。

表3 各组大鼠肾组织NQO1、HO-1、Nrf2及Keap1蛋白相对表达量比较（）

表3 各组大鼠肾组织NQO1、HO-1、Nrf2及Keap1蛋白相对表达量比较（）

注：与NC组比较，*P＜0.05；与CM组比较，#P＜0.05；与低剂量组比较，△P＜0.05。

组别低剂量组中剂量组高剂量组NC组DM组CM组Keap1 1.00 ± 0.05 1.03 ± 0.05 1.19 ± 0.01 0.97 ± 0.07 0.94 ± 0.08 0.92 ± 0.01 n8 8 8 1 0 8 9 NQO1 1.86 ± 0.07*＃Δ 2.12 ± 0.10*＃2.69 ± 0.09*＃1.63 ± 0.12 1.51 ± 0.02＃Δ 1.15 ± 0.02*HO-1 1.74 ± 0.04＃Δ 2.23 ± 0.17*＃2.34 ± 0.13*＃1.60 ± 0.10 1.45 ± 0.07＃Δ 1.28 ± 0.11*Nrf2 1.33 ± 0.06＃Δ 1.99 ± 0.11*＃2.02 ± 0.11*＃1.38 ± 0.14 1.12 ± 0.03*＃Δ 0.61 ± 0.07*

3 讨论

随着现代介入技术及影像学的快速发展，含碘造影剂在疾病诊断和治疗过程中的使用越来越普遍，造影剂诱导急性肾损伤日益受到重视。造影剂诱导急性肾损伤不仅影响患者的预后，亦可显著增加患者远期心血管及肾脏不良事件［5］。因此，重视造影剂诱导急性肾损伤的早期防治，具有重要的临床和现实意义。

目前有关造影剂诱导急性肾损伤的发病机制仍未充分阐明，多数研究认为含碘造影剂致肾小管供氧失衡和对细胞直接毒性是其发生和发展的主要机制［6-7］，其中氧化应激损伤是其发生发展的关键环节［8］。在氧化应激情况下，活性氧（ROS）过量生成是多数肾脏病变的共性，ROS能够激活对氧化还原敏感的转录因子及信号传导通路，引起细胞凋亡、组织损伤、坏死、炎症及纤维化等病化。研究表明，在基础肾功能正常的人群中，糖尿病被认为是造影剂诱导急性肾损伤的独立预测因子［1］。本研究发现，糖尿病大鼠给予造影剂尾静脉注射后，其肾功能指标显著下降，氧化应激损伤指标SOD水平显著降低，MDA水平明显升高，其原因可能为在高血糖状态下，肾脏组织已处于明显的氧化应激状态，大量的氧自由基对肾脏循环产生缩血管效应，在一定程度上加重肾脏的缺血，在使用造影剂后加剧氧化应激损伤，从而更易发生严重的急性肾损伤。HE染色也显示，糖尿病大鼠给予造影剂干预后，其肾小球病理改变显著，主要表现为肾小球肿胀明显，体积变大，肾小球囊腔变窄，肾小管上皮细胞出现重度肿胀及空泡样变性，肾间质被大量炎性细胞浸润。含碘造影剂既可以通过直接毒性损伤血管内皮细胞，诱发糖尿病大鼠肾小管上皮细胞空泡化变性及部分细胞坏死，又能够激活氧化应激系统，产生大量的ROS集聚体内，导致肾脏组织损伤。因此，阻断或者减轻氧化应激反应对降低DM患者发生造影剂诱导急性肾损伤具有重要临床意义。

Nrf2在肾脏疾病的发生发展中具有重要作用。激活Nrf2可以提高细胞或组织的抗氧化应激能力，从而减轻机体损伤。Khaleel 等［9］研究发现，在造影剂诱导急性肾损伤大鼠模型中，SCr和BUN水平明显升高，Nrf2基因的表达受到抑制，其调控的下游基因HO-1、NQO1过表达。给予糖尿病小鼠及高糖干预的肾小球系膜细胞Nrf2激动剂叔丁基对苯二酚（tBHQ）后，肾脏和肾小球系膜细胞氧化应激损伤明显减轻，其作用机制与Nrf2 信号通路的激活有关［10］。由此可以看出，Nrf2活化剂介导的Nrf2 活化以及调控下游抗氧化酶的表达可能在预防造影剂诱导急性肾损伤过程中发挥重要作用，但目前还没有某一抗氧化剂能有效防治造影剂诱导急性肾损伤。

葡萄籽原花青素提取物是从葡萄籽中提炼出来的天然多酚化合物， 研究显示，葡萄籽原花青素提取物可以降低炎症水平，提高抗氧化酶水平，抑制氧化应激损伤和线粒体功能受损，缓解2型DM大鼠的肾功能损伤［11］，亦可以改善糖尿病大鼠肾缺血再灌注损伤［12］。本研究结果显示，糖尿病大鼠给予不同剂量的葡萄籽原花青素提取物灌胃预处理后，肾功能指标SCr、BUN水平呈剂量依赖性下降，氧化应激损伤指标SOD水平呈剂量依赖性升高，MDA水平呈明显下降趋势。肾脏组织HE染色显示CM组肾组织病理损害最为显著，给予由低到高不同剂量的葡萄籽原花青素提取物灌胃预处理后，各组肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性及间质炎性浸润逐渐改善。结果提示，葡萄籽原花青素提取物能够减轻含碘造影剂对糖尿病大鼠的肾脏损伤，并与剂量相关。有研究表明，葡萄籽原花青素提取物能够升高顺锈铂诱导肾病小鼠体内的SOD 含量，通过抗氧化作用对顺锈铂诱导的肾病小鼠起到保护作用［13］。王芳等［14］研究发现，原花青素能够升高糖尿病小鼠血清SOD含量，而降低MDA的水平，从而改善机体的氧化应激损伤。针对葡萄籽原花青素提取物是否能预防造影剂诱导急性肾损伤引起的肾小管上皮细胞凋亡，本研究采用TUNEL法检测了各组细胞凋亡情况，发现葡萄籽原花青素提取物具有剂量依赖的抗细胞凋亡作用。

氧化应激损伤是公认的导致细胞凋亡的重要机制之一，Nrf2-Keap1信号通路是抗氧化应激的主要细胞防御系统，是阻断氧化应激致组织损伤的有效靶点［15］。在正常情况下，Nrf2通过与负性调控因子Keap1的结合，以非活性胞质形式存在，从而促使Nrf2的降解［16］。抗氧化触发Nrf2与Keap1发生解离并Nrf2核易位，然后结合到抗氧化反应元件（ARE），激活内源性抗氧化系统，促进各种抗氧化酶的活化，从而发挥其抗氧化应激的作用［17］。有研究［18］证明，增加小鼠 Nrf2 及其下游靶基因HO-1、NQO1的表达可以改善肾小管上皮细胞凋亡，且肌酐、尿素氮含量明显降低。给予抗氧化剂激活 Nrf2 信号通路可以缓解缺血再灌注导致的肾损伤［19-20］。以上研究均表明，Nrf2 可以通过上调下游抗氧化酶的表达，从而缓解氧化应激损伤，使肾脏得到相应的保护。本研究结果显示，糖尿病大鼠给予造影剂干预后，其Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达显著降低，证明了在糖尿病状态下造影剂可以明显抑制Nrf2信号通路，抑制抗氧化酶HO-1、NQO1的表达，加重氧化应激损伤。给予不同剂量的葡萄籽原花青素提取物预处理后，发现葡萄籽原花青素提取物可以上调糖尿病大鼠肾脏 Nrf2 的蛋白及mRNA的表达，并且可以上调Nrf2信号通路下游相关基因HO-1、NQO1 的蛋白及mRNA的表达，缓解肾脏损害。表明葡萄籽原花青素提取物可激活Nrf2的表达并参与介导转录，从而降低肾组织的氧化应激损伤。

综上所述，葡萄籽原花青素提取物预灌胃的尾静脉注射造影剂糖尿病大鼠血清SCr、BUN水平低，肾组织匀浆组SOD水平高、MDA水平低，肾小管上皮细胞凋亡指数小，且500 mg/kg时效果最好。葡萄籽原花青素提取物可能通过促进肾组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达，进一步抑制肾组织MDA表达，发挥抗氧化应激损伤作用。