铁死亡抑制剂预培养的大鼠心肌细胞抵抗素诱导后细胞肥大程度及铁死亡相关蛋白表达观察

朱贲贲 ，海日汗 ，王巍嵩 ，杨鹏杰

1 内蒙古自治区肿瘤医院药剂科，呼和浩特 010020；2 内蒙古医科大学附属人民医院药剂科；3 内蒙古医科大学麻醉系；4 内蒙古医科大学附属医院药学部；5 内蒙古自治区肿瘤医院胸外科；6 内蒙古医科大学附属人民医院胸外科

心肌肥厚（Cardiac Hypertrophy）的终末阶段为心力衰竭（Heart Failure）。全世界范围内心力衰竭的发病率和病死率均较高［1-2］。抵抗素是由脂肪细胞产生和分泌的一种分泌蛋白［3-4］。动物实验［5］发现，抵抗素可诱导胚胎大鼠心肌细胞肥大。临床研究［6］发现，心力衰竭患者血清抵抗素水平升高。推测抵抗素在心肌细胞肥大过程中可能发挥重要作用。铁死亡（Ferroptosis）是一种新型的细胞程序性死亡方式，是细胞内铁依赖脂质活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）积聚过多而导致的一种可调节性的细胞死亡形式［7］。研究［8］发现，铁代谢异常可能与心力衰竭的发生有关。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）是一种ROS清除剂［9］，可显著提高阿霉素（Doxorubicin，DOX）诱导心力衰竭小鼠的存活率［10］。抵抗素是否通过铁死亡途径导致心肌细胞肥大，目前相关研究较少。我们观察了Fer-1预培养的大鼠心肌细胞系H9c2抵抗素诱导后细胞肥大程度及铁死亡相关蛋白的表达情况，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂 H9c2细胞购于协和细胞库，使用完全DMEM培养基进行培养，待贴壁细胞达培养瓶底面积80%～90%时备用。重组人抵抗素购自美国Peprotech，Fer-1购于美国 Sima-aldrich，完全 DMEM培养基购于美国Gibco，谷胱甘肽过氧化物酶 4（Glutathione Peroxidase 4，GPX4）、酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4（Acyl-CoA synthetase long-chain family member ，ACSL4） 及环氧合酶 2（COX2）抗体购于美国Abcam。

1.2 H9c2细胞分组及Fer-1、抵抗素干预方法 取H9c2细胞，1×105/孔分别接种于6孔板内，加入完全DMEM培养基3 mL，细胞贴壁后换含0.1% FBS的DMEM培养基 3 mL饥饿培养16 h（以便后续药物吸收）。将 H9c2细胞分为 1、2、3、4组。1组用含1 μmmol/L的Fer-1培养基培养16 h，后换为含50 ng/mL抵抗素的培养基培养32 h。2组用含1 μmmol/L的Fer-1培养基培养16 h，后换为含0.1% FBS的培养基培养32 h。3组用含50 ng/mL抵抗素的培养基培养48 h。4组（正常对照组）用含0.1% FBS的培养基培养48 h。

1.3 各组细胞肥大程度观察

1.3.1 各组细胞表面积测算 于倒置显微镜下观察各组细胞形态，随机选取3个不同的视野进行拍照，每视野随机选取5个细胞，采用Image J软件测算各细胞的表面积，以所有细胞的表面积之和为各组细胞表面积，重复测算3次，取平均值。

1.3.2 各组单细胞蛋白含量测算 取各组细胞，BCA法测算各组单细胞蛋白含量。 配制蛋白标准液，分别吸取10 μL标准品及样品依次加入96孔板内，加入 200 μL BCA 工作液/孔，37 ℃恒温孵育30 min，酶标仪波长调至562 nm进行检测。根据已知标准蛋白浓度与吸光值绘制标准曲线，通过函数根据已知吸光值测定待测蛋白浓度C。单细胞蛋白含量=细胞总蛋白浓度C×裂解液体积V/细胞总数n。重复测算3次，取平均值。

1.3.3 各组心肌细胞肥大相关胚胎基因ANP、BNP和β-MHC基因检测 采用RT-qPCR法检测心肌细胞ANP、BNP和β-MHC基因，取各组细胞，提取RNA后根据逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR检测各组细胞中ANP、BNP和β-MHC的表达量。反应体系：RNase Free dH2O 9.5 μL，cDNA/DNA 1 μL，上游引物 1 μL，下 游 引 物 1 μL，2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL。引 物 序 列 为 ANP-F：5'-CTTCGGGGGTAGGATTG ACA-3'，ANP-R：5'-AATGCGACCAAGCTGTGTGAC-3'；BNP-F：5'-CCAAGATGGCACATAGTTCAAGC-3'，BNP-R：5'-AGAGCCGCAGGCAGAGTCA-3'；β -MHF：5'-GAAAGCAACTGGAGGCTGAGA-3’，β-MH-R：5'-CATCTCCTCGTCCTTCTCTGC-3'；ACTIN-F：5'-A GAGGGAAATCGTGCGTGA-3’，ACTIN-R：5'-CAT TGCCGATAGTGATGACCT-3'。反应条件：预变性95 ℃ 10 min；变性 95 ℃ 10 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40 个循环。以 β-actin 为内参，以 2-ΔΔCt代表目的基因的相对表达量，每组重复检测3次，取平均值。

1.4 各组细胞铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶 4（ Glutathione Peroxidase 4，GPX4）、酰基辅酶 A合成酶长链家族成员 4（Acyl-CoA synthetase longchain family member ，ACSL4） 、环氧合酶 2（COX2）检测 采用Western Blotting法检测各组细胞GPX4、ACSL4、COX2。取各组细胞，加入预冷过RIPA裂解液充分裂解，4 ℃下离心15 min，取上清，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度 ，加入1/4体积的蛋白上样缓冲液，100 ℃、5 min加热变性，采用SDS-PAGE法电泳分离。分别加入1：1 000比例稀释的GPX4、ACSL4、COX2一抗，4 ℃环境过夜孵育。将二抗以1∶10 000比例进行稀释，PVDF膜避光常温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次15 min。采用荧光成像系统测得对应灰度值，以β-actin为内参，用Image J软件测算目的蛋白的灰度值，以目的蛋白灰度值/内参灰度值为目的蛋白的相对表达量，重复测算3次，取平均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据处理。P-P图检验数据的正态性，符合正态分布的计量资料以-表示，两组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌细胞表面积比较 1、2、3、4组心肌细 胞 表面积分别为（2 181.02 ± 210.89）、（1 964.96 ± 187.51）、（3 602.93 ± 347.47）、（1 522.54 ± 431.93）pixel，与4组比较，3组细胞表面大（P＜0.05）；与3组比较，1组细胞表面积小（P＜0.05）。

2.2 各组心肌细胞单细胞蛋白含量比较 1、2、3、4组心肌细胞单细胞蛋白含量分别为（680.00 ±41.15）、（540.67 ± 87.19）、（1 115.67 ± 77.84）、（457.67 ± 67.30）pg/L，与4组比较，3组心肌细胞单细胞蛋白含量高（P＜0.05）；与3组比较，1组心肌细胞单细胞蛋白含量低（P＜0.05）。

2.3 各组心肌细胞ANP、BNP、β-MHC基因的相对表达量比较 各组心肌细胞ANP、BNP、β-MHC基因相对表达量比较见表1。

表1 各组心肌细胞ANP、BNP、β-MHC基因相对表达量比较（-）

表1 各组心肌细胞ANP、BNP、β-MHC基因相对表达量比较（-）

注：与4组比较，# P ＜0.05；与3组比较，*P ＜0.05。

组别1组2组3组BNP基因3.14 ± 0.56*1.84 ± 0.83 4.25 ± 0.86#ANP基因2.32 ± 0.54*1.55 ± 0.46 4.91 ± 0.58#β-MHC基因1.76 ± 0.29*1.39 ± 0.19 2.43 ± 0.49#

2.4 各组心肌细胞GPX4、ACSL4、COX2相对表达量比较 各组心肌细胞GPX4、ACSL4、COX2相对表达量比较见表2。

表2 各组心肌细胞GPX4、ACSL4、COX2相对表达量比较（-x ± s）

3 讨论

心肌肥厚是由多种因素引起的心肌组织超负荷的适应性反应，可分为生理性和病理性。持续的病理性心肌肥厚最终可导致扩张性心肌病、心力衰竭和猝死［11］。目前，心肌肥厚的分子及细胞信号转导机制仍不明确。抵抗素是一种由小鼠脂肪细胞产生的分子。研究［12］发现，心力衰竭患者的血清抵抗素水平升高。最新研究［13］发现，暴露于高水平血清抵抗素的一般人群比较低水平血清抵抗素的人群有更高的心血管死亡风险。本研究中，抵抗素组与空白组对比，抵抗素组心肌细胞表面积显著增加。抵抗素组单细胞蛋白质含量也显著增加，心肌细胞肥大标志物ANP、BNP和β-MHC基因相对表达量升高，说明抵抗素成功诱导心肌细胞的肥大。

Ferroptosis是以铁依赖性脂质过氧化为特征的调节性细胞死亡 （RCD） 形式。迄今为止，铁死亡与退行性疾病（亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病和帕金森病）、缺血再灌注损伤和心血管疾病等有关。例如ACSL4和p53诱导的GPX4和凋亡诱导因子线粒体相关2（AIFM2）抑制铁死亡。TADOKORO等［14］发现，阿霉素通过线粒体途径下调 GPX4 诱导铁死亡，同时GPX4过表达通过调节铁死亡改善心脏功能。FAN等［15］研究，发现，ACSL4过表达损害了黄芩苷在H9c2细胞中产生的保护作用。此外，ZHU等［16］等研究发现，铁死亡可作为导致自身免疫性肝炎的引发剂或中间介质。本研究结果，发现在抵抗素诱导的心肌细胞肥大中，抵抗素组与正常对照组相比，GPX4蛋白表达下调，ACSL4、COX2蛋白表达上调，提示抵抗素诱导H9c2心肌细胞肥大途径中铁死亡被激活。1组与3组相比，GPX4蛋白表达上调，ACSL4、COX2蛋白表达下调，提示Fer-1可以缓解抵抗素诱导的心肌细胞肥大过程中铁死亡的发生，可能与Fer-1引发脂质氢过氧化物的消失作用有关［17］。在我们的研究中，1组H9c2细胞的表面积明显减小、单细胞蛋白含量明显减少、心肌细胞胚胎基因（ANF、BNF及β-MHC）表达明显下调。说明Fer-1的干预对抵抗素诱导的心肌细胞肥大有保护作用，同时抵抗素诱导心肌细胞肥大的过程中，有铁死亡的途径被激活，铁死亡可能成为治疗心肌肥大患者的新靶点。

综上所述，抵抗素可诱导H9c2心肌细胞肥大。与加入抵抗素培养者相比，先后加入Fer-1与抵抗素培养的大鼠心肌细胞系H9c2肥大程度轻、GPX4蛋白表达增加、ACSL4及COX2蛋白表达降低。Fer-1可能通过促进铁死亡相关蛋白GPX4表达、抑制ACSL4及COX2蛋白表达，抑制抵抗素诱导的H9c2肥大。Fer-1预处理可能对抵抗素诱导的心肌细胞肥大有一定保护作用。但铁死亡参与抵抗素诱导的心肌细胞肥大的具体作用机制今后仍需进一步研究。