靶向CD19 的CAR-NK92 细胞构建及其对相关肿瘤细胞的杀伤作用观察

董宇曦，余卓营，冯义超，王建勋

北京中医药大学生命科学学院，北京 102488

近年来，嵌合抗原受体（CAR）-T 疗法在肿瘤相关研究领域发展迅速，CAR-T 细胞在肿瘤治疗中发挥着日益重要的作用［1］。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤特异性抗原缺乏、低水平CAR-T 细胞浸润和肿瘤抗原逃逸等因素，以及CAR-T 细胞治疗可能导致靶向非肿瘤效应、神经毒性和细胞因子释放综合征（CRS）等不良反应，使得CAR-T 疗法的应用受到限制［2］。因此，研究人员提出用NK 细胞替代T 细胞表达CAR。相对于CAR-T 细胞，CAR-NK 细胞可以从多种来源获得，如NK92 细胞系、脐带血单核细胞、外周血单核细胞及诱导的多能干细胞等［3-4］。CAR-NK 细胞在血循环中寿命有限，对正常组织的靶向/脱靶毒性风险相对较低，不易发生CRS和神经毒性，安全性更高，且不受供体—患者匹配影响［5-9］。现阶段CAR-NK 细胞相关研究中所使用的CAR 结构大多为CAR-T 细胞的CAR 结构。虽然CAR-NK 细胞和CAR-T 细胞杀伤肿瘤的方式相似，但它们的激活信号转导通路不同。因此，设计开发出能有效激活NK 细胞的CAR 结构将有助于提高CAR-NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。基于此，2021 年3 月—2022 年6 月，本 研 究设计了2 种契合NK 细胞自身信号转导通路的靶向分化群抗原19（CD19）的二代CAR 结构，构建了靶向CD19的CARNK细胞，并观察其对多种肿瘤细胞的杀伤作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及实验试剂 逆病毒包装细胞系及人骨髓瘤B 细胞RPMI-8226 细胞、人Burkkit 淋巴瘤Daudi 细胞购于美国ATCC 细胞库，人结直肠腺癌SW620 细胞购于国家生物医学实验细胞资源库，NK92细胞购自中国武汉普诺赛生命科技有限公司，黑人Burkitt 淋巴瘤Raji-luc 细胞由北京维通达生物科技有限公司惠赠。RPMI1640培养基、DMEM 培养基、胎牛血清、PBS 缓冲液、胰酶、Penicillin Streptomycin 购自美国Gibco 公司，FuGene HD 转染试剂购自美国Promega公司，α-MEM 培养基、热灭活马血清购自以色列BI 公司，Myc-PE、BCMA-PE、CD19-APC等抗体购自美国BD 公司。人γ-干扰素ELISA 检测试剂盒购自中国百诺威生物科技有限公司，ClonExpress Ulter One StepCloning Kit 无缝克隆试剂盒、胶回收试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒、质粒纯化试剂盒、Bright-Lumi Ⅱ萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒、Annexin V-Alexa Flour 647/PI凋亡检测试剂盒、病毒RNA 提取试剂盒、Evo M-MLV 反转录试剂盒Ⅱ、First-strand cDNA Synthesis Mix 去基因组反转录试剂盒、DH5a化学感受态细胞、XhoⅠ/NotⅠ限制性内切酶、BamHI-HF 内切酶、T4 DNA Ligase 连接酶等购自北京兰博利德有限公司。

1.2 CAR001、CAR002 质粒构建 靶向CD19 的单链可变区（SCFV）来自实验室早期筛选的具有较强亲和力的靶向CD19 的CAR 结构，SCFV 与CD8跨膜区及2B4、DAP12 或CD3ζ 胞内区进行串联，在此结构基础上加入SP 信号肽和MYC 检测标签。用XhoI/NotI 限制性内切酶将SCFV 与pMFG 逆转录病毒载体进行双酶切，回收纯化片段后用T4 DNA Ligase 连接酶将目的片段与载体进行连接。使用DH5a 化学感受态细胞对连接后的DNA 进行转化。将转化产物离心，弃500 μL 上清后均匀涂板，将平板置于37 ℃恒温培养箱培养12 ～ 16 h，待平板上长出菌落后挑取单克隆菌落，将其加入到含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中培养12 ～ 16 h，用培养后的菌液进行质粒提取并送至测序公司测序。CAR001、CAR002 质粒结构见图1。

图1 CAR001、CAR002质粒结构

1.3 CAR001-NK92、CAR002-NK92 细胞的构建将测序正确的CAR001、CAR002 质粒进行逆转录病毒载体的包装，收集逆转录病毒载体并进行滴度检测，用滴度较高（高于106copies/mL）的逆转录病毒载体进行后续NK92 细胞转导。实验操作如下：用Retronectin 进行过夜铺板，第2天将Retronectin 吸出并加PBS 润洗，弃掉PBS；各取CAR001、CAR002 质粒成功包装的逆转录病毒载体1 mL 于细胞转导板上，离心后弃掉液体；加入NK92细胞继续离心，离心后弃掉液体，加入培养基，置于5% CO2、37 ℃培养箱孵育24 h后，将细胞转到6孔板继续培养3 d；第4天用Alexflour 488 anti-c-MYC 对转导后的细胞进行染色，使用流式细胞仪检测转导效率；第7天使用流式细胞仪分选出经Alexflour 488 anti-c-MYC 染色后MYC抗体呈阳性的NK92细胞，并进行扩大培养，96 h后检测分选后细胞MYC 表达情况；继续培养细胞，4个月后取适量NK92 细胞、CAR001-NK92 细胞、CAR002-NK92 细胞 分别 与CD19 Protein-FITC 抗 体共孵育培养1 h，用流式细胞仪检测两种CAR-NK92细胞对CD19 抗原的结合能力，若结合力强，证明靶向CD19抗原的CAR-NK92细胞系构建成功。

1.4 表达CD19 抗原的肿瘤细胞的构建及验证购买含人源CD19 抗原序列的质粒，构建表达CD19抗原的Raji-luc、SW620-EGFP、RPMI-hCD19-copGFP细胞。取不染色的肿瘤细胞Daudi、Raji-luc、SW620-EGFP、RPMI-hCD19-copGFP 细胞作为阴性对照，离心去上清，再加入PBS清洗后弃上清，使用APC antihuman CD19 抗体对Daudi、Raji-luc、SW620-EGFP、RPMI-hCD19-copGFP 细胞进行染色，离心去上清，使用含10%血清的PBS 重悬细胞，流式细胞仪检测肿瘤细胞中的CD19抗原。

1.5 靶向CD19的CAR-NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤作用观察

1.5.1 CAR-NK92 细 胞 对RPMI-hCD19-copGFP 细胞的杀伤作用观察 采用流式细胞术。以RPMIhCD19-copGFP 细胞为靶细胞，制备细胞悬液，调整细胞密度为2×105/mL、每孔100 μL。分别将NK92细胞、CAR001-NK92 细胞、CAR002-NK92 细胞作为效应细胞，将靶细胞和效应细胞分别按1∶4、1∶2、1∶1、2∶1效靶比（当效靶比为1∶1时，效应细胞密度为2×105/mL、每孔100 μL）在5% CO2、37 ℃条件下共孵育，设置仅含靶细胞的对照孔。共孵育6 h后，300 g、5 min 离心弃上清，收集细胞，用染色缓冲液进行清洗，再加入BCMA-PE抗体进行染色，在4 ℃冰箱孵育1 h。终止染色，离心去上清，再加入Annexin-V染色，在4 ℃冰箱孵育45 min后终止染色，离心去上清。使用染色缓冲液重悬细胞，使用流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡率。效应细胞对肿瘤细胞的杀伤效率=实验孔靶细胞凋亡率-对照孔细胞凋亡率。

1.5.2 CAR-NK92 细胞对Raji-luc 细胞的杀伤作用观察 采用荧光素酶报告基因法。以Raji-luc 细胞为靶细胞，制备细胞悬液，以4×105/mL、每孔50 μL接种于96 孔板。分别将NK92 细胞、CAR001-NK92细胞、CAR002-NK92细胞作为效应细胞，将靶细胞和效应细胞分别按1∶4、1∶2、1∶1、2∶1效靶比在5% CO2、37 ℃条件下共孵育6 h，设置仅含靶细胞的对照孔和仅含培养基的空白孔。使用酶标仪进行检测。细胞杀伤效率=［1-（实验孔OD 值-空白孔OD 值）/（最大释放孔OD值-空白孔OD值）］×100%。

1.5.3 CAR-NK92 细胞对SW620-EGFP 细胞的杀伤作用观察 采用IncuCyte 法。将SW620-EGFP 作为靶细胞，以4×104/孔、每孔100 μL接种于96孔板。分 别将NK92 细胞、CAR001-NK92 细 胞、CAR002-NK92细胞作为效应细胞，将靶细胞和效应细胞分别按1∶4、2∶1 效靶比在5% CO2、37 ℃条件下共孵育18 h。以每孔0 h 时的荧光面积作为原始对照。杀伤效率=（原始荧光面积-当前拍照时荧光面积）/原始荧光面积×100%。

1.5.4 CAR-NK92细胞对Daudi细胞增殖的影响观察 采用流式细胞术。使用Daudi细胞作为靶细胞，以2×105/mL、每孔100 μL 接种于96 孔板，分别将NK92细胞、CAR001-NK92细胞、CAR002-NK92细胞作为效应细胞（分别为NK92 组、CAR001-NK92 组、CAR002-NK92组）共培养，1 500 r/min离心5 min，弃上清，PBS 清洗。加入CFSE 溶液重悬细胞，37 ℃水浴避光孵育30 min 后加入PBS 终止染色，离心去上清，用α-MEM完全培养基重悬制成2×105/mL的细胞悬液，加入96孔板中，每孔加入100 μL，将培养板置于5% CO2、37 ℃培养箱培养24 h，流式细胞术检测CFSE平均荧光强度，表示细胞增殖能力。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism8 软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 靶 向CD19 的CAR001-NK92、CAR002-NK92细胞构建情况 CAR001-NK92、CAR002-NK92 细胞CAR 表达率分别为99.0%和98.4%，CD19 表达率分别为99.6%和99.3%。成功构建靶向CD19 的CAR001-NK92、CAR002-NK92细胞。

2.2 表达CD19抗原肿瘤细胞的构建情况 Daudi、Raji-luc、SW620-EGFP、RPMI-hCD19-copGFP 细胞的CD19 抗原表达率分别为99.0%、100%、100%、99.5%，表达CD19抗原的肿瘤细胞构建成功。

2.3 CAR-NK92 细胞 对RPMI-hCD19-copGFP 细胞的杀 伤效果 NK92 细胞、CAR001-NK92 细胞、CAR002-NK92 细胞在不同效靶比下对RPMIhCD19-copGFP 细胞的杀伤效率依次增高（P均＜0.01）。三种细胞对RPMI-hCD19-copGFP 细胞的杀伤效率随效靶比增高而增高。见表1。

2.4 CAR-NK92 细胞对Raji-luc 细胞的杀伤效果 CAR002-NK92 细胞在不同效靶比下对Raji-luc 细胞的杀伤效率均高于CAR001-NK92 细胞（P均＜0.01）。三种细胞对Raji-luc细胞的杀伤效率随效靶比增高而增高。见表1。

2.5 CAR-NK92 细胞对SW620-EGFP 细胞的杀伤效果 NK92 细胞、CAR001-NK92 细胞、CAR002-NK92 细胞在不同效靶比下对SW620-EGFP 细胞的杀伤效率依次增高（P均＜0.05）。三种细胞对SW620-EGFP 细胞的杀伤效率随效靶比增高而增高。见表1。

表1 CAR-NK 细胞与NK92 细胞不同效靶比下对肿瘤细胞的杀伤效率比较（%，± s）

表1 CAR-NK 细胞与NK92 细胞不同效靶比下对肿瘤细胞的杀伤效率比较（%，± s）

注：与NK92细胞相比，*P＜0.01；与CAR001-NK92细胞相比，#P＜0.01。

杀伤细胞杀伤效率RPMI-hCD19-copGFP细胞Raji-luc细胞SW620-EGFP细胞CAR001-NK92细胞 效靶比1∶4 效靶比1∶2 效靶比1∶1 效靶比2∶1 CAR002-NK92细胞 效靶比1∶4 效靶比1∶2 效靶比1∶1 效靶比2∶1 NK92细胞 效靶比1∶4 效靶比1∶2 效靶比1∶1 效靶比2∶1 13.3 ± 0.5*20.0 ± 1.7*35.0 ± 3.3*56.3 ± 3.4*6.2 ± 1.8 15.3 ± 4.4 22.0 ± 2.2 55.2 ± 7.0-40.3 ± 2.1*49.0 ± 5.6*15.8 ± 0.6*#26.4 ± 0.5*#45.3 ± 3.5*#65.2 ± 1.4*#17.0 ± 3.5#33.6 ± 5.1#62.1 ± 1.4#79.1 ± 3.7*22.3 ± 2.5*72.7 ± 0.6*-2.4 ± 0.9 0.3 ± 1.8 3.4 ± 0.4 8.6 ± 0.6 13.8 ± 3.0 31.8 ± 3.8 53.5 ± 5.6 73.9 ± 4.5-56.7 ± 3.8-15.0 ± 5.3

2.6 CAR-NK92 细胞对Daudi 细胞增殖能力的影响 NK92组、CAR001-NK92组、CAR002-NK92组荧光强度分别为10 464.7 ± 624.2、9 186.3 ± 399.1、10 217.7 ± 107.5。NK92 组和CAR002-NK92 组细胞增殖能力低于CAR001-NK92组（P均＜0.05）。

3 讨论

NK 细胞是先天淋巴样细胞家族成员［10-11］，可以对病毒感染、转化的细胞作出反应，具有多种效应功能，主要是细胞杀伤和产生促炎细胞因子［11-14］。与T细胞相反，NK细胞是缺乏抗原特异性受体的淋巴细胞，但大量表达神经细胞黏附分子，也被称为CD56［15］。两 个 最 具 特 征 的NK 细 胞 亚 群 是CD56brightCD16-dim和CD56dimCD16*bright［16］。组 织 常驻NK 细胞主要是CD56bright，外周血中CD56bright数量较少，循环中90%的NK细胞是CD56dim［17］。NK细胞上受体信号输入情况决定了NK细胞是否激活并产生细胞毒性，当抑制受体信号转导总体水平超过激活受体信号转导时，NK细胞激活受到阻碍，导致产生细胞耐受［16］。在病毒感染或转化时，NK细胞激活受体（如NKG2D）的刺激配体（如MHC-Ⅰ同源分子MICA、MICB）表达上调［18］，诱导的激活信号水平超过抑制性受体（如NKG2A）的信号，从而激活NK 细胞细胞因子的释放和针对靶细胞的细胞毒性［16］。CD56brightNK细胞是强大的细胞因子生产者［16］，而CD56dimNK细胞群可介导感染和针对恶性细胞的杀伤作用［19］。

CAR-NK 细胞疗法与CAR-T 治疗相比，其优势包括：①免疫细胞的获得不再局限于自体细胞［20］，CAR-NK 细胞疗法的免疫细胞来源包括人外周血NK 细胞、脐带血NK 细胞、诱导多能干细胞、NK92细胞系等［3-4］。②使用CAR-NK 治疗的患者CRS 和神经毒性发生率较CAR-T 治疗更低［20-21］，CAR-T 细胞和CAR-NK 细胞毒性的差异可能是由细胞活化时释放的细胞因子的差异引起的［20］，CAR-T 细胞活化导致炎症因子（如肿瘤坏死因子α、白细胞介素2、白细胞介素6）释放［22］，而CAR-NK 细胞释放不同类型的细胞因子，如粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）［23］。③除了CAR 途径外，NK 细胞还具有多种靶向和消灭肿瘤细胞的机制，包括NK 细胞可介导抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用，也可以通过接触和（或）脱离细胞表面的杀伤细胞免疫球蛋白样受体来杀死肿瘤细胞［24-25］。

本研究使用病毒包装和流式分选的方法成功构建出靶向CD19 的CAR001-NK92 细胞和CAR002-NK92 细胞，且CAR-NK92 细胞能与靶抗原CD19 特异性结合。为了验证构建的CAR-NK92细胞对肿瘤具有杀伤能力，本研究构建并采用表达CD19 抗原的RPMI-hCD19-copGFP 细胞、Raji-luc 细胞、SW620-EGFP 细胞和Daudi 细胞作为靶细胞，采用不同细胞杀伤实验检测了NK92 细胞和CAR-NK92 细胞对靶细胞的杀伤效率，结果显示，NK92 细胞、CAR001-NK92 细胞、CAR002-NK92 细胞在不同效靶比下对RPMI-hCD19-copGFP 细胞和SW620-EGFP 细胞的杀伤效率依次增高；CAR002-NK92 细胞在不同效靶比下对Raji-luc 细胞的杀伤效率均高于CAR001-NK92细胞；NK92 组和CAR002-NK92 组细胞增殖能力低于CAR001-NK92组。由此可以看出，本研究设计的CAR 结构在构建CAR-NK 细胞后可有效杀伤表达CD19抗原的肿瘤细胞，且杀伤作用随效靶比的增高而增强。CAR-NK 细胞治疗方案在血液肿瘤和实体瘤治疗方面具有较好的应用前景，然而本研究为细胞实验，未来将进一步开展动物实验、临床治疗试验，验证CAR-NK细胞的具体疗效。