罗哌卡因对人软骨细胞C28/I2的损伤诱导作用观察及机制探讨

刘晨光，张义华，曾炼，罗辉宇，丁旭东

1 锦州医科大学湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院研究生联合培养基地麻醉科，湖北 襄阳 441000；2 湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院麻醉科；3 湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院康复科

骨关节炎是由多种原因引起的慢性退行性疾病［1］，其带来的疼痛和运动障碍影响患者正常生活，最终可导致功能丧失。骨关节炎目前无法根治，治疗目的主要是减轻疼痛、恢复基本的关节活动、避免功能丧失［2］。关节腔内注射局麻药物被广泛用于骨关节炎及关节手术后镇痛，有助于功能恢复。罗哌卡因作用时间长、毒性小，是临床常用的酰胺类局麻药物［3］。有研究发现，局部麻醉药物的毒性作用在软骨细胞中也有表现［4］。罗哌卡因会影响细胞钾通道和钙通道，影响线粒体功能，导致细胞损伤。理论上，适度自噬在线粒体功能受损时起到保护作用，但当自噬超过细胞的最大适应能力时，则会引发线粒体功能障碍，最终导致软骨细胞死亡。自噬还可通过降解铁蛋白、减少铁储存、导致铁“超载”从而促进铁死亡，进一步导致细胞死亡。研究认为，罗哌卡因能够促进神经元细胞发生自噬，但关于罗哌卡因对软骨细胞自噬和铁死亡的影响报道较少。2022 年3 月—7 月，本研究观察了罗哌卡因对人软骨细胞C28/I2 的损伤诱导作用，并基于自噬和铁死亡探索相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与主要材料 C28/I2 细胞株购于中国科学院上海细胞资源中心。高糖DMEM 培养基和胎牛血清购自Gibco 公司，罗哌卡因购自辰欣药业公司，CCK-8 试剂盒购自Biosharp 公司，活性氧试剂盒和JC-1 试剂盒购自凯基生物公司，SDS-PAGE试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司。一抗：GAPDH 购自Absin 公司，LC3、p62 购自三鹰公司、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、重组人铁蛋白重链1（FTH1）购自Cellsignal 公司；HRP 标记的荧光二抗IgG购自杭州碧云天生物公司。酶标仪购自Molecular Devices公司，倒置显微镜购自Olympus公司。

1.2 细胞分组及处理 将C28/I2 细胞置于含10%胎牛血清、1%双抗的高糖培养基中，于37 ℃、5% CO2、95%湿度条件下培养。适当换液保持细胞良好状态，待细胞融合达60% ～ 80%时，用胰酶消化细胞，进行传代。将细胞随机分对照组、实验1 组、实验2 组、实验3组。实验1、2、3组分别给予0.25、0.50、1.00 mmol/L的罗哌卡因处理48 h；对照组不添加药物。

1.3 细胞活力检测 将C28/12 细胞接种到96 孔板，3×103/孔，每孔加入100 μL 培养基。待细胞状态良好、细胞增殖达60% ～ 80%，参照“1.2”分组操作，每组设3个复孔，培养48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8 溶液，37 ℃摇床孵育2 ～ 4 h。用酶标仪测定每个孔的光密度（OD）值，以对照组细胞活力为100%，以没有细胞且有CCK-8 试剂的空白孔调零，计算各组细胞存活率。细胞存活率=实验组OD 值/对照组OD值×100%。

1.4 细胞形态观察 将C28/I2细胞接种于12孔板中，5×105/孔，取对数增殖期的细胞进行实验，分组处理方式同“1.2”。培养48 h后，显微镜下选取多个视野，观察各组细胞形态并拍照记录。

1.5 细胞线粒体活性氧（ROS）及线粒体膜电位检测 将C28/I2细胞接种于24孔板中，5×105/孔，分组处理方式同“1.2”。培养48 h 后，弃掉孔中培养基，用PBS 洗涤2 次。使用ROS 红色荧光探针二氢乙啶标记细胞DNA中的ROS，37 ℃孵育20 min，PBS洗涤2 次。荧光显微镜下观察，采集相应的白光图像，采用Image J 软件分析ROS 平均荧光强度。采用JC-1法测定线粒体膜电位。按照试剂说明书配置JC-1工作液，每孔加入200 μL 的JC-1 工作液覆盖细胞，37 ℃孵育20 min，用PBS 洗涤2 次；多聚甲醛室温固定，PBS洗涤2次，加入细胞核染料进行核复染，室温15 min；荧光显微镜下观察并拍照，采用Image J软件分析各组平均荧光强度，表示膜电位大小。

1.6 细胞中自噬相关蛋白及铁死亡相关蛋白检测 采用Western blotting法。将C28/I2细胞接种于6 孔板中，5×107/孔，分组处理方式同“1.2”。培养48 h 后，弃掉孔中培养基，用PBS 洗涤2 次，每孔加入蛋白裂解液，在冰上放置15 min，超声间断震碎细胞。放入4 ℃离心机，13 000 r/min、离心15 min，收集上清液，加入蛋白上样缓冲液，煮沸使蛋白变性，使用BCA 试剂盒检测蛋白浓度。每孔上样蛋白量25 μg，电泳并转膜，脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST 洗膜后加入稀释一抗LC3（1∶2 000）、p62（1∶1 000）、GPX4（1∶1 000）、FTH1（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃摇床孵育过夜，TBST 洗膜3 次。加入羊抗鼠荧光二抗IgG（1∶2 000），室温孵育1.5 h，TBST洗膜3次。ECL显影，曝光，使用Image J软件分析蛋白条带灰度值并进行相对定量。

1.7 统计学方法 采用SPSS22.0 软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞活力比较 实验1、2、3组及对照组细胞存活率分别为98% ± 1%、84% ± 3%、22% ± 2%，100% ± 1%。各实验组细胞存活率低于对照组，且实验1、2、3组细胞存活率依次下降（P均＜0.05）。

2.2 各组细胞形态变化 对照组细胞呈多边形、三角形等不规则形态，细胞体积大，具有人软骨细胞的结构及特征。各实验组随着罗哌卡因作用浓度增加，软骨细胞数量逐渐减少，细胞形态逐渐变得细长，胞质减少，部分细胞呈球状、皱缩，凋亡、坏死细胞数量增多。见图1。

图1 各组细胞形态变化

2.3 各组细胞线粒体ROS 及线粒体膜电位比较对照组及实验1、2、3组线粒体ROS水平分别为1.00 ± 0.11、1.91 ± 0.18、2.48 ± 0.19、3.51 ± 0.44，线粒体膜 电位 分别 为1.31 ± 0.12、0.84 ± 0.08、0.68 ± 0.06、0.51 ± 0.04。实验3 组细胞线粒体ROS 水平高于对照组，实验1、2、3组细胞线粒体ROS水平依次升高（P均＜0.05）。对照组、实验1组、实验2组、实验3组线粒体膜电位依次降低（P均＜0.05）。

2.4 各组细胞自噬相关蛋白及铁死亡相关蛋白表达比较 对照组、实验1组、实验2组、实验3组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ依次增加，p62、FTH1、GPX4 蛋白表达依次下降（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞自噬相关蛋白及铁死亡相关蛋白表达比较（± s）

表1 各组细胞自噬相关蛋白及铁死亡相关蛋白表达比较（± s）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与实验1组相比，#P＜0.05；与实验2组相比，△P＜0.05。

GPX4 0.91 ± 0.12*0.80 ± 0.08*#0.47 ± 0.02*#△1.05 ± 0.10组别实验1组实验2组实验3组对照组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.15 ± 0.25*1.35 ± 0.28*#2.65 ± 0.50*#△0.25 ± 0.05 p62 0.65 ± 0.13*0.47 ± 0.08*#0.18 ± 0.06*#△1.30 ± 0.09 FTH1 0.82 ± 0.04*0.70 ± 0.10*#0.24 ± 0.06*#△0.94 ± 0.07

3 讨论

骨关节炎好发于中老年人。我国人口老龄化趋势明显，骨关节炎发病率较高。骨关节炎导致的疼痛、运动障碍、关节畸形、肌肉萎缩等极大降低了患者的生活质量［5］。目前对于骨关节炎的治疗主要是减轻疼痛、改善功能、延缓疾病进展。罗哌卡因作为酰胺类局部麻醉药的代表，被广泛应用于周围神经阻滞，用于骨折固定术后镇痛并减轻局部炎症反应，还可用于骨关节炎及关节镜手术后镇痛。近年来，大量研究表明罗哌卡因可对软骨细胞产生毒性作用，但机制尚不清楚［6］。SILVA 等［7］研究显示，罗哌卡因通过降低细胞活力、增加细胞凋亡和引起细胞外基质损伤对软骨细胞产生毒性作用。本研究发现，罗哌卡因作用于软骨细胞后，细胞活力降低且作用呈浓度依赖性，软骨细胞形态也发生变化［8］，随着罗哌卡因作用浓度增加，软骨细胞数量逐渐减少，细胞形态变得细长，胞质减少，部分细胞呈球状、皱缩，凋亡、坏死细胞数量增多，与相关研究结果一致。

JAYARAM 等［9］研究显示，罗哌卡因的软骨毒性是由线粒体DNA 损伤导致软骨细胞凋亡或坏死引起的。线粒体是细胞进行有氧呼吸的部位，通过氧化磷酸化产生ATP，维持机体生存所需能量。细胞在损伤过程中会发生氧化应激，导致ROS 生成增多，线粒体膜电位降低，引发线粒体功能障碍，而受损的线粒体会进一步激活线粒体自噬［10］。自噬可将受损的细胞成分转运至溶酶体，使其被降解和循环再利用［11］。自噬的特殊类型——线粒体自噬可清除功能失调和受损的线粒体，维持细胞内稳态，保证能量供给［12］。通常情况下，自噬对细胞起到保护作用，然而当自噬激活超过一定范围时，则可导致细胞损伤，包括加剧损伤进程及降解正常线粒体成分，最终导致细胞死亡［13］。曾炼等［14］的研究指出，罗哌卡因可促进神经元细胞发生自噬，导致神经元细胞凋亡。本研究发现，罗哌卡因作用后，软骨细胞线粒体ROS生成增加，线粒体膜电位降低，引起线粒体功能障碍；并且，罗哌卡因可促使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化，自噬小体增多，自噬底物p62 水平降低，自噬水平增加。

有研究表明，自噬可以促进铁死亡的发生［15-16］，其机制可能与减少铁储存、导致铁累积有关。铁蛋白是一种细胞内广泛存在的储铁蛋白，由FTL1 和FTH1 两个铁蛋白组件构成。细胞内游离的Fe2+由转铁蛋白转运至铁蛋白中存储，维持细胞铁元素平衡。自噬可降解FTH1/FTL1复合物，释放大量Fe2+，增加细胞内铁水平，促进铁死亡。铁死亡是一种具有铁依赖性的、通过细胞膜上过载的脂质过氧化引发的细胞死亡方式［17］。铁死亡的生物特征主要有细胞线粒体皱缩、嵴减少、膜密度升高、线粒体膜破裂增加、谷胱甘肽耗竭及细胞内Fe2+和ROS 的聚积等［18］。脂质过氧化的过程依赖于GPX4 的失活。PARK 等［19］研究发现，抑制GPX4表达可导致细胞内发生铁介导的过氧化反应，从而诱导铁死亡。HU等［20］发现，GPX4 可保护造血干细胞及祖细胞免受脂质过氧化和铁死亡。本研究结果提示，罗哌卡因作用于软骨细胞后，可导致细胞中FTH1 表达减少，GPX4活性抑制，最终引发软骨细胞发生铁死亡。

综上所述，罗哌卡因可诱导软骨细胞发生损伤，降低细胞活力，破坏细胞形态，增强氧化应激，导致线粒体功能障碍，且作用呈剂量依赖性；罗哌卡因对软骨细胞的损伤诱导作用可能与上调细胞自噬水平和诱导铁死亡有关。然而，本研究为体外实验，罗哌卡因在体外和体内的扩散具有一定差异，后续我们将继续进行动物实验来验证以上结论。