用于乙型肝炎病毒相关研究的人源化嵌合肝脏小鼠模型应用进展

沈磊，张思航，周太成，韦嘉

1 昆明医科大学第四附属医院感染科，昆明 650000；2 云南大学附属医院中心实验室；3 云南大学附属医院感染科

尽管已有多种抗HBV 疗法应用于临床，但HBV感染仍是全球主要的公共卫生问题［1-2］。由于HBV的宿主范围狭窄，导致建立理想的HBV 感染动物模型成为难题。近年来，人源化小鼠模型引起了越来越多学者的关注［3-4］。人源化小鼠模型是一类携带人的功能基因、细胞、组织或器官的小鼠模型；人源化嵌合肝脏小鼠模型是具有肝损伤及免疫缺陷特点的小鼠模型，常通过手术、药物或基因编辑来破坏小鼠肝细胞，再将人肝细胞在小鼠脾内注射，移植的人肝细胞通过小鼠脾静脉和门静脉迁移到肝脏，并开始增殖以取代损伤的小鼠肝细胞，进而形成嵌合肝脏小鼠［5］。与HBV 转基因小鼠模型、高压水动力注射小鼠模型及病毒载体介导小鼠模型相比，人源化嵌合肝脏小鼠模型可被HBV 成功感染，且支持完整的HBV 生命周期，可产生具有转录活性的共价闭合环状双链DNA（cccDNA）［6-7］，是当前HBV 研究及新药研发的重要工具［8］。现就HBV研究相关的人源化嵌合肝脏小鼠模型应用进展综述如下，为相关研究中HBV易感动物模型的选择提供参考。

1 基于Alb-uPA小鼠的嵌合肝脏模型

Alb-uPA 转基因小鼠是HECKEL 等于1990年研发，主要用于新生儿出血性疾病的研究［9］。该模型中，小鼠携带尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA），并由白蛋白（Alb）启动子控制。该模型通过上调小鼠体内uPA 表达，导致小鼠形成严重的低纤维蛋白原血症和肝细胞损伤。Alb-uPA 小鼠模型的肝损伤状态为外源性肝细胞的植入创造了条件。在此背景下，研究人员将uPA转基因小鼠与免疫缺陷鼠如无胸腺（nu/nu）裸 鼠、重 组 体 激 活 基 因2（Rag2）敲 除（Rag2-/-）小鼠或重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠进行杂交，得到Alb-uPA/Rag2-/-或Alb-uPA/SCID 等免疫缺陷型肝损伤小鼠模型［10-11］。

该模型可被HBV 成功感染，且模型的构建无外源性药物干预，可适用于临床抗HBV 相关药物研究。KLUMPP 等［12］发现，在Alb-uPA/SCID 小鼠中，衣壳组装调节剂NVR3-778 比恩替卡韦具有更高的抗病毒活性，可同时降低血清HBV DNA、HBV RNA水平。研究人员还利用该小鼠模型证明了HBV 感染不能诱导肝细胞干扰素应答［13］。然而，该模型易导致新生小鼠出血及肾脏疾病，且小鼠繁殖效率低、移植时间窗窄，阻碍了Alb-uPA小鼠模型的应用［14］。

2 Alb-rtTA/TRE-uPA嵌合肝脏小鼠模型

为优化Alb-uPA 小鼠模型，SONG 等［15］将TREuPA 转基因小鼠与Alb-rtTA 转基因小鼠杂交，构建出Alb-rtTA/TRE-uPA 小鼠。在四环素强力霉素作用下，反义四环素转录活化因子（rtTA）与四环素应答元件（TRE）结合并激活靶基因转录，uPA 在小鼠肝细胞中表达并引起广泛肝损伤。在此基础上，将Alb-rtTA/TRE-uPA 小鼠连续8 代回交到NRG（NOD背景的Rag2nullIl2rgnull小鼠）背景，获得Alb-rtTA/TRE-uPA/Rag2null/Il2rgnull小鼠，简称URG 小 鼠。在此模型中，可以通过调节Ad. TRE-uPA 及四环素强力霉素的剂量来控制肝损伤程度，实现肝损伤可控，以利于后续的人肝细胞体内植入和增殖。

与原uPA 小鼠相比，URG 小鼠需要长期使用外源性药物四环素强力霉素诱导肝损伤，但该模型实现了uPA 仅在肝内可控性表达，成功解决了传统Alb-uPA 嵌合小鼠模型的缺陷问题，使其繁殖效率显著提高，潜在出血情况减少，移植时间窗更加灵活，从而使该模型的应用范围更加广泛。LI 等［16］通过URG 小鼠模型验证了肝细胞样细胞的功能有效性，使肝功能衰竭的恢复成为可能。YANG 等［17］使用该小鼠模型发现组蛋白乙酰基转移酶1的表达与HBV 复制呈正相关，并证实组蛋白乙酰基转移酶1信号通路参与HBVcccDNA 小染色体的组装和表观遗传调控。

3 FRG嵌合小鼠模型

2007 年，AZUMA 等［18］通过将延胡索乙酰乙酸水解酶（FAH）基因敲除小鼠（FAH-/-）与RAG2-/IL2RG-/-双重免疫缺陷小鼠杂交，首次构建出FAH-/-RAG2-/IL2RG-/-（FRG）小鼠。白细胞介素2（IL-2）受体γ链（IL-2Rγ）与淋巴细胞增殖活化及NK细胞的发育密切相关，将其敲除可使小鼠T 淋巴细胞和B 淋巴细胞的发育和功能严重受损，并完全阻断NK 细胞的发育。富马酰乙酰乙酸酯水解酶（FAH）是酪氨酸代谢过程中所必需的酶，其缺失会导致富马酰乙酰乙酸酯在肝细胞中积累，后者对肝细胞具有毒性作用，进而导致肝细胞损伤［19］。为防止FRG 小鼠肝细胞中富马酰乙酰乙酸酯过度积累，可通过口服2-（2-硝酸-4-三氟甲基苯甲酰）-1，3-环己基二酮（NTBC）来阻断FAH 上游的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性，从而起到减轻肝损伤的作用［20］。

FRG 嵌合小鼠模型可以通过给予或停用NTBC来控制小鼠肝损伤程度，可以在任何鼠龄植入人肝细胞，并且可以连续多次植入［21］，人肝细胞嵌合率高达95%［20］。然而，Fah 小鼠也会因Ⅰ型酪氨酸血症而发展为肝癌，并且需要在人源化后继续或间歇性地进行药物治疗以抑制肝癌的发展［22］。

4 TK-NOG嵌合小鼠模型

为了克服uPA/SCID 和FRG 小鼠的缺陷，日本学者将NOD/scid 小鼠和γ 链IL-2 受体敲除鼠进行杂交，构建出免疫缺陷NOD/Shi-scid（NOG）小鼠［23］。将单纯疱疹病毒1 型胸苷激酶（HSVtk）表达片段显微注射到NOD/Shi 品系小鼠受精卵中，构建HSVtk转基因小鼠，再将雌性转基因小鼠与雄性NOG 小鼠交配，从而产生TK-NOG 小鼠。HSVtk 转基因构建体包含小鼠白蛋白增强子/启动子，HSVtk mRNA 在TK-NOG小鼠肝脏中选择性表达，使TK-NOG小鼠发生特异性肝损伤［24］。

在TK-NOG 小鼠模型中，表达HSVtk 的小鼠肝细胞暴露于更昔洛韦后发生凋亡，使得移植的人肝细胞在小鼠肝脏中稳定维持。该小鼠模型造模成功后，后续无需外源性药物维持，且增加更昔洛韦剂量可提高人肝细胞移植率。该小鼠模型成功感染HBV 后，可至少连续20周观察到肝组织中HBs抗原呈阳性［25］。此外，与uPA/SCID 和FRG 小鼠模型相比，TK-NOG 小鼠模型的主要优势是不易出现肾病、肝脏肿瘤等疾病，其主要缺点是雄性小鼠不育［26］。

5 人源化双嵌合小鼠模型

5.1 AFC8-hu HSC/Hep 双嵌合小鼠模型 虽然上述人鼠嵌合肝脏模型成功克服宿主物种限制和疾病建模方面的障碍，但小鼠缺乏免疫系统，使其无法用于研究宿主免疫反应和肝炎病毒诱导的免疫病理。2011年，WASHBURN等及ROBINET等［27-28］研发出一种具有人免疫系统和人肝细胞的人源化双嵌合小鼠模型，即AFC8-hu HSC/Hep 小鼠模型。研究人员将FK506结合蛋白（FKBP）-Caspase-8结合蛋白（AFC8）基因转入Balb/C Rag2-γ C-null 小鼠受精卵中，构建出AFC8转基因小鼠。FKBP与白蛋白启动子激活的Caspase-8结合，在AP20187的诱导下，可使小鼠肝细胞发生特异性凋亡。在此基础上，将人原代肝细胞（Hep）和CD34+造血干细胞（HSC）移植到AFC8 转基因小鼠体内，即构成AFC8-hu HSC/Hep 双嵌合小鼠模型［29-30］。

此模型可同时具备人免疫系统及人肝细胞，在HBV 免疫机制研究及疫苗研发中具有极大的应用前景。然而该模型不仅造模困难、费用昂贵，而且人肝细胞嵌合率较低，远不及Alb-uPA/SCID、FRG 等人源化小鼠模型的人源化肝脏重建率，使得该模型无法广泛应用于HBV相关研究［31］。

5.2 A2/NSG-hu HSC/Hep双嵌合小鼠模型 BILITY等［32］将人原代肝细胞和CD34+造血干细胞直接注入HLA-A2转基因的NOD/SCID/IL2rγnull（NSG）新生小鼠（A2/NSG）肝脏，实现人肝细胞及免疫系统双嵌合。A2/NSG小鼠携带人类HLA-A2基因，可促进主要组织相容性复合体限制T细胞的发育［33］。在该模型中使用小鼠特异性抗Fas激动剂抗体可使小鼠肝细胞发生特异性凋亡，从而使移植的人肝细胞具有再生优势［34］。

与其他人源化嵌合肝脏小鼠相比，A2/NSG-hu HSC/Hep 双嵌合小鼠模型不仅具有人肝细胞和免疫系统，还支持HBV持续性感染、抗HBV免疫反应，且可在HBV 感染的嵌合肝组织中观察到活化的人M2 样巨噬细胞积累。该模型最显著的缺点为人肝细胞来自胎儿肝祖细胞，且移植水平相对较低（20%），导致该小鼠模型血液HBV 滴度较低，同时也存在动物伦理的限制［35］。

总之，发展有前景的HBV 易感动物模型是研究HBV 感染机制、开发HBV 感染新疗法的关键。由于HBV 及动物模型的自身生理特性，高压水动力注射模型、转基因小鼠模型及病毒载体介导小鼠模型等均无法在小鼠体内形成HBVcccDNA，使其难以为后续研究提供强有力的科学支撑。相比之下，人肝嵌合小鼠不仅对HBV 感染敏感，而且能够在小鼠体内形成HBVcccDNA，是当前模拟临床HBV感染患者的最佳模型，被广泛应用于肝损伤、基因调节、药物毒性和嗜肝病毒感染等相关研究中，并为抗HBV 药物的研发与评估提供了实验基础。目前为止，已有多种人源化嵌合小鼠模型被研发出来，具有各种优点和局限性。人源化嵌合肝脏小鼠模型主要面临着价格昂贵、制备过程复杂、技术要求苛刻、无法遗传等共性问题。随着实验技术的发展，相信以上种种限制会被逐一攻克，且在已有技术条件基础上，最终服务于临床，为HBV患者提供更加精准的个性化治疗。