响应面法优化牡丹籽粕蛋白提取工艺及其功能性质

陈晨，李成忠*，张焕新，王宇麟

江苏农牧科技职业学院（泰州 225300）

牡丹是属于毛茛科和牡丹科的落叶灌木植物[1]，具有重要的观赏价值、食用价值及药用价值。牡丹籽含油量20%以上，其亚麻酸和亚油酸含量丰富，可加工成调和油，同时还可加工成各种食品、保健品[2]。牡丹籽榨油后产生大量牡丹籽粕，约占牡丹籽总量的80%。牡丹籽粕中蛋白质含量在20%～30%[3-4]，具有合理的氨基酸组成和良好的功能特性，是一种优质的蛋白质资源[5]，可应用于食品工业或化妆品行业，不仅能够大幅提高牡丹籽副产物的综合利用率，提高产品的附加值，还能处理好牡丹籽粕废弃引起的资源浪费与环境问题。

试验在碱提酸沉基础上，利用超声辅助酶法提取牡丹籽粕蛋白，利用响应面法优化工艺条件，并分析蛋白质的功能性质，以期为牡丹籽粕蛋白综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牡丹籽粕：将牡丹籽脱壳后，使用高速粉碎机粉碎，经石油醚脱脂后于50 ℃热风干燥箱中烘干，过0.250 mm孔径（60目）筛备用；石油醚（沸程60～90 ℃，上海沃凯生物技术有限公司）；氢氧化钠、盐酸（分析纯，上海苏懿化学试剂有限公司）；糖化酶（活力80 U/g，南宁庞博生物工程有限公司）；大豆分离蛋白（郑州莫达化工有限公司）；硼酸、甲基红、溴甲酚绿（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

KQ-250B型超声清洗器（南京旭析仪器有限公司）；Centrifuge 5810R型高速冷冻离心机（上海迪图生物科技有限公司）；EL602型电子分析天平（苏州市莱顿科学仪器有限公司）；台式冻干机（北京华谊伟业科技有限公司）；KDN-04型消化炉（上海新嘉电子有限公司）；DFT-100型手提式高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；S21-Ni4型恒温水浴锅（江苏省金坛市金城国晟仪器实验厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 牡丹籽粕蛋白等电点的测定[6]

称取适量脱脂牡丹种子粉置于250 mL烧杯中，按1∶20（g/mL）料液比加入蒸馏水，用0.5 mol/L NaOH溶液调至pH 10，放入超声清洗器中，于50 ℃超声恒温反应100 min，离心（4 800 r/min，15 min），得到上清液。分取上清液6份各15 mL，用0.5 mol/L盐酸分别调节至pH 3.0，3.5，4.0，4.5，5.0和5.5，在转速4 800 r/min下离心15 min，将上清液去除，将沉淀干燥后称其质量，将沉淀量（干燥后的沉淀质量/原料质量）与pH对应关系作图，沉淀量最高时的pH即为牡丹籽粕蛋白等电点。

1.3.2 牡丹籽粕蛋白制备工艺[7]

牡丹籽粕粉→加蒸馏水→调节pH至碱性→在固定功率200 W下超声碱提→4 800 r/min离心15 min→ 上清液调pH至等电点→4 800 r/min离心15 min→沉淀加水溶解→调pH→加糖化酶酶解→灭酶→调pH至中性→离心→沉淀洗涤→冻干→牡丹籽粕粗蛋白

蛋白质得率=提取得到蛋白质的质量/原料质量×100% （1）

1.3.3 牡丹籽粕蛋白提取工艺单因素试验

以料液比、超声温度、超声时间和酶添加量为影响因素，采用超声辅助酶法提取，研究各单因素对牡丹籽粕蛋白质得率的影响。料液比为1∶6，1∶8，1∶10，1∶12和1∶14（g/mL）；超声处理时间为60，80，100，120和140 min；超声温度分别为45，50，55，60和65 ℃；糖化酶剂量分别为1%，2%，3%，4%和5%。

1.3.4 牡丹籽粕蛋白提取工艺响应面试验

基于单因素试验基础，以超声温度（A）、超声时间（B）、料液比（C）、糖化酶剂量（D）为自变量，牡丹籽粕蛋白得率为响应值（Y），使用Design-Expert V8.0.6软件，进行四因素三水平响应面分析，建立牡丹籽粕蛋白得率的二次多项式数学模型。试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计

1.3.5 牡丹籽粕蛋白功能性质评价

1.3.5.1 持水性[8]

称取0.5 g牡丹籽粕蛋白质（m0）置于干燥离心管中，称量蛋白质和离心管的质量（m1），加10 mL去离子水，搅拌均匀后在60 ℃下水浴加热30 min，冷却至室温，离心（4 800 r/min，10 min），弃上清液，擦干离心管内外壁的水分后称其质量（m2），样品的持水性（g/g）按式（2）计算。

1.3.5.2 吸油性[9]

称取0.5 g牡丹籽粕蛋白，置于离心管中，加入5.0 mL大豆油，混匀后在室温下静置0.5 h，离心（4 800 r/min，15 min），记下游离油的体积。样品的吸油性（mL/g）按式（3）计算。

1.3.5.3 乳化性和乳化稳定性[10]

称取1 g牡丹籽粕蛋白质，加入蒸馏水25 mL搅拌分散，加入大豆油5 mL，以2 000 r/min均匀搅拌，以3 000 r/min离心5 min，样品的乳化性按式（4）计算。

1.3.5.4 起泡性与起泡稳定性[11]

称取1 g牡丹籽蛋白，溶于50 mL去离子水中，调节pH至中性，搅拌10 min，定容为100 mL测试溶液，以1 000 r/min搅拌3 min，记录上层泡沫体积（V1）。静置30 min后，再次记录上层的泡沫体积（V2）[11]。样品的起泡性和起泡稳定性按式（6）和（7）计算。

2 结果与分析

2.1 牡丹籽粕蛋白等电点分析

图1 不同pH下的沉淀量

蛋白质在等电点时，蛋白质分子呈电中性，分子间凝聚从而析出沉淀，因此可根据沉淀量的大小判断牡丹籽蛋白质等电点[12]。牡丹籽粕蛋白沉淀量随着pH增加呈现先升高后降低趋势，pH 4.0时，沉淀量最大，此时接近蛋白质等电点。

2.2 单因素条件对牡丹籽粕蛋白得率的影响

2.2.1 料液比对牡丹籽粕蛋白得率的影响

由图2可见，料液比1∶6～1∶14（g/mL）时，随着液体占比的增加，牡丹籽粕蛋白质得率先增加后下降，这可能是因为液体占比增大，牡丹籽粕粉与溶剂的接触面积增加，蛋白质的分散效率提高，所以蛋白得率增加[13]。但过大的液体占比反而使蛋白质提取率降低，可能是因为在浓度过低的分散体系中易导致处理时溶质丢失，还会造成后续成本和水的耗量过多。因而，选择料液比1∶10（g/mL）为最佳。

图2 料液比对蛋白质得率的影响

2.2.2 超声时间对牡丹籽粕蛋白得率的影响

由图3可见，超声提取时间60～120 min时，随着超声时间的增加，牡丹籽粕蛋白质得率增加，这是因为超声波的机械与空化作用的影响，会增加碱液对原料细胞的渗透，适当延长超声时间，能使牡丹籽粕中的蛋白质尽可能溶解在溶剂中[14]，超声提取时间超过120 min时，蛋白质产量开始随时间下降，可能是因为提取时间过长导致蛋白质凝聚沉淀，在后续离心过程中与沉淀一起除去，上清液中蛋白质含量降低，得率减小。因此选择超声时间120 min为最佳。

图3 超声时间对蛋白质得率的影响

2.2.3 超声温度对蛋白得率的影响

由图4可见，超声温度升高时，蛋白质得率先升高后降低，这可能是温度的升高使得蛋白质溶解度增大，溶解在碱液中的蛋白质增加，50 ℃时得率最高，温度继续升高时，蛋白质会发生热变性，部分溶解的蛋白质会发生交联聚合，蛋白质的溶解度降低使得蛋白质得率降低。因此，超声提取适宜的温度条件为50 ℃。

图4 超声温度对蛋白质得率的影响

2.2.4 糖化酶剂量对牡丹种子粉蛋白得率的影响

随着糖化酶剂量的增加，牡丹籽粕蛋白得率呈上升趋势，可能是糖化酶水解牡丹籽粕中的淀粉，加速了蛋白质的溶出。糖化酶剂量2%时蛋白得率最高，继续增加糖化酶剂量，蛋白质得率变化不大，糖化酶的作用达到饱和，因而选择糖化酶最优用量为2%。

图5 糖化酶剂量对蛋白质得率的影响

2.3 响应面优化试验设计分析

2.3.1 牡丹籽粕蛋白提取结果

为进一步优化牡丹籽粕蛋白提取工艺，根据前期单因素试验结果，以超声时间、超声温度、料液比、糖化酶剂量为自变量，牡丹籽粕蛋白得率为响应值，响应面试验设计和结果见表2。

2.3.2 响应面试验回归模型的建立

采用Design-Expert V8.0.6b软件对表2的试验结果进行回归分析，得到回归模型：蛋白质得率Y=25.70+0.75A+0.94B+0.42C+0.48D-0.77AB-0.20AC+0.46AD-1.63BC-0.66BD-2.06CD-2.05A2-2.71B2-2.16C2-4.08D2。对回归模型的方差分析结果如表3所示。

表2 响应面法试验设计及结果

由表3可知：该模型F=10.91，P＜0.000 1，表明牡丹籽粕蛋白提取效果回归模型极显著；回归方程失拟值为0.17（P=0.601 8＞0.05），表明失拟项与纯误差相关不显著；决定系数R2=0.916 0，C.V.=5.42%。因此，模型的拟合程度较好，置信度高，使用该方程可对牡丹籽粕蛋白得率进行预测与分析。

表3 牡丹籽粕蛋白得率试验方差分析结果

模型自变量的一次项A、B对蛋白质得率影响呈显著水平（P＜0.05）；超声温度和料液比交互项显著，料液比和糖化酶剂量交互性极显著，其他交互因素不显著；在二次项中A2、B2、C2、D2效果极显著，说明各影响因素对蛋白质得率的影响不是简单线性关系；由F值大小可以看出，牡丹籽粕蛋白质得率的影响因素大小顺序为B＞A＞D＞C，即超声温度＞超声时间＞糖化酶剂量＞料液比。

2.3.3 响应面分析与优化

根据回归方程，得到影响牡丹籽粕蛋白质提取因素的响应面图和等高线图（图6）。响应面曲线图可以直观反映2个因素交互作用对牡丹籽粕蛋白得率影响的显著程度。响应曲面形状越陡峭，对蛋白质得率影响越大。等高线的形状反映因素交互作用的强弱，如果等高线轮廓形状趋向于椭圆形，则交互作用明显，如果轮廓形状趋向于圆形，则交互作用不明显。

图6表明，糖化酶添加量和料液比在图上表现为曲面陡峭，对牡丹籽粕蛋白质得率影响较显著。糖化酶添加量与料液比、超声温度与料液比的相互作用明显，等高线轮廓线呈椭圆形。

图6 各交互因素对牡丹籽粕蛋白得率影响的响应面图和等高线图

2.3.4 模型的验证性试验

通过软件分析得出，超声温度50.71 ℃、超声时间119.75 min、料液比1∶9.98（g/mL）、糖化酶剂量2.01%是牡丹籽粕蛋白质提取的最佳工艺条件。在此条件下，牡丹籽粕蛋白质得率的预测值可达25.845%。根据实际操作情况，将牡丹籽粕蛋白质提取的最佳条件修正为糖化酶剂量2%、提取温度50 ℃、料液比1∶10（g/mL）、提取时间120 min。试验后测得蛋白质得率为26.65%，与预测结果的偏差为0.805%，模型的有效性得到验证。测得该工艺条件下提取的蛋白质含量为91.02%，纯度较高。

2.4 牡丹种子蛋白功能性质

大豆分离蛋白以其良好的功能特性，可作为食品添加剂被广泛应用于食品加工中，如肉制品、焙烤食品、乳制品生产等。将提取的牡丹籽粕蛋白的功能特性与大豆分离蛋白进行比较，结果如表4所示。

蛋白质的持水性是指蛋白质在一定条件下受热后保持水分的能力，吸水性有助于减少水分流失，从而起到改善食品口感和质地的作用。蛋白质籽粕蛋白的持水能力比大豆蛋白高（见表4），可能是超声提取牡丹籽粕蛋白时，超声波的作用使得蛋白质充分由大分子变成小分子，更多蛋白质分子亲水基团暴露在表面，与水分子之间的作用力增加，提高了蛋白质的持水性[5]。吸油性是指吸附油脂并截留油于组织内部的能力，牡丹籽粕蛋白的吸油性略低于大豆分离蛋白，与油脂等疏水性物质的相互作用较小，不适合应用在油脂类食品生产中。乳化性是指蛋白质与水、油作用后形成乳浊液的能力，乳化性能好的蛋白质更适合应用在油脂类食品生产中[15]。牡丹籽粕蛋白质的乳化性略低于大豆分离蛋白，乳化稳定性强于大豆分离蛋白，将其作为乳化剂应用具有一定优势[16]。蛋白质良好的发泡性会赋予食物良好的口感及松软的组织结构，通常应用在焙烤食品加工中。牡丹籽粕蛋白起泡性不如大豆分离蛋白，但是泡沫稳定性较好。

表4 牡丹籽粕蛋白与大豆分离蛋白功能性质比较

3 结论

利用超声波辅助糖化酶法提取牡丹籽粕蛋白，在单因素试验基础上，采用响应面优化法优化蛋白质提取工艺条件，并研究在此条件下制备的牡丹籽粕蛋白功能性质。结果发现：牡丹籽粕蛋白提取的工艺最优条件为料液比1∶10（g/mL）、糖化酶剂量2%、超声温度50 ℃、超声时间120 min。此条件下牡丹籽粕蛋白质得率为26.65%，牡丹籽粕蛋白中的蛋白质含量为91.02%。对蛋白质得率产生影响的因素主次顺序为超声温度＞超声时间＞糖化酶剂量＞料液比。试验结果为牡丹籽粕蛋白工业化生产提供依据。牡丹籽粕蛋白的持水性、泡沫稳定性和乳化稳定性均比大豆分离蛋白好，但吸油性、乳化性和起泡性弱于大豆蛋白。