葫芦籽的超声波辅助三相分配提取工艺

黄正虹，汪祖华*

1.贵州中烟工业有限责任公司技术中心（贵阳 550000）；2.贵州中医药大学药学院（贵阳 550000）

葫芦是葫芦科的一种常见草本植物，被广泛种植于亚洲、欧洲和南美洲。葫芦籽含有丰富的不饱和脂肪酸和生物活性物质的油[1]、蛋白质、植物甾醇、维生素和多糖。研究表明，葫芦籽油具有极好的保健功效；葫芦籽油提取的蛋白质具有抑制细菌生长、抑制炎症和降低血糖等生理功能；从葫芦果肉中提取的多糖具有增加血清胰岛素水平、降低血糖水平和改善葡萄糖耐量的能力，可用作新型抗胰岛素剂[2-4]。

超声波辅助三相分配提取（UTPP）技术是一种绿色、高效的提取方法，是将粗提取物或悬浮液与固体盐和有机溶剂混合，同时形成三种不同的相[4]。上相是叔丁醇层，主要含有脂类、色素等非极性化合物，中间的沉淀相是蛋白质层，下面的水相是水层，其中含有一些极性化合物，如多糖。

近年来，虽然UTPP技术应用于从天然作物中提取和纯化酶、脂质、蛋白质、多糖和其他物质，但是很少使用UTPP技术同时提取油、蛋白质和多糖的研究。因此，研究的目的是通过UTPP技术同时提取分离CSO、CSP和CSPS。研究考察了硫酸铵添加量、叔丁醇与浆液的比例、pH、超声功率、辐射时间和占空比对CSO、CSP和CSPS提取率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

葫芦籽于中国内蒙古自治区巴彦淖尔市杭锦后旗市场购买。将干净的葫芦籽放入DZF-6250真空干燥器（上海友谊仪器有限公司）中，在60 ℃和25 kPa下干燥24 h，达到2 g/100 g的含水量。研磨后，葫芦籽通过0.425 mm筛，密封在密封袋中，储存在4 ℃直到提取。正己烷[国药试剂公司（上海市），色谱纯]。其他试剂（包括叔丁醇、硫酸铵、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、苯酚、硫酸）均购自国药试剂公司（上海市），分析纯。

1.2 葫芦籽组分分析

参照AOCS[5]的标准方法分析了葫芦籽的水分、油和蛋白质含量，参照AOAC[6]的标准方法分析了灰分含量。葫芦籽粉的含油量为46.17±0.11 g/100 g，蛋白质含量为30.25±0.23 g/100 g，初始含水量为9.43±0.11 g/100 g，总灰分含量为5.54±0.16 g/100 g。

1.3 UTPP提取CSO，CSP，CSPS工艺

葫芦籽浆是通过将葫芦籽粉与蒸馏水以1∶20（g/mL）混合来制备的。在室温下，将一定比例的(NH4)2SO4（10～50 g/100 mL）添加到葫芦籽混合物中，并轻轻搅拌使其充分混合。使用0.1 mol/L盐酸溶液和0.1 mol/L NaOH溶液将混合物的pH调节至3～7。然后，按体积比（叔丁醇/浆液=0.5∶1.0～2.5∶1.0）加入叔丁醇。

使用20 kHz频率的钛超声波探头对混合物进行超声处理，该探头浸入样品溶液中，距底部1.5 cm的深度。在脉冲模式下，混合物处理一定时间（5～25 min），同时保持一定的超声波功率（30～150 W）和一定的占空比（20%～100%）。为了避免定位效应，使用圆底玻璃反应器。用冰浴冷却系统，使所有样品的温度保持在25 ℃以下。超声处理后，将混合物以7 600×g离心20 min，形成界限分明的三相。对上层溶剂层进行负压蒸发以回收叔丁醇，并将获得的CSO样品储存在4 ℃下。CSO提取率按式（1）计算。

CSO提取率=葫芦籽提取物中油脂的含量（g/100 g）/所用的葫芦籽颗粒原料中油脂的含量（g/100 g）×100% （1）

中间层主要由沉淀的CSP和脱脂葫芦籽组成，并记录中间相的体积。将中间层的沉淀物溶解在pH 8.0的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液中，在4 ℃放置超过12 h，并在蒸馏水中透析，然后将上清液冷冻干燥以获得CSP。获得的CSP储存在4 ℃下，以供进一步研究。牛血清蛋白标准曲线由考马斯亮蓝比色法制备。CSP提取率按式（2）计算。

CSP提取率=葫芦籽提取物中蛋白的含量（g/100 g）/所用的葫芦籽颗粒原料中蛋白的含量（g/100 g）×100% （2）

下层水相主要由CSPS和(NH4)2SO4组成。首先记录所获得的下层溶液的体积，用蒸馏水透析并冷冻干燥以获得CSPS。CSPS储存在4 ℃下，供后续研究使用。用苯酚-硫酸法（以d-葡萄糖为标准）测定样品在波长490 nm处的吸光度，计算出样品中CSPS的含量，进而计算出葫芦籽多糖的提取率。CSPS提取率按式（3）计算。

CSPS提取率=葫芦籽提取物中多糖的含量（g/100 g）/所用的葫芦籽颗粒原料中多糖的含量（g/100 g）×100% （3）

1.4 响应面法的优化试验

在单因素试验的基础上，选择响应面法中的Box-Behnken试验设计进行参数优化，以获得最佳响应值。以超声功率（A）、辐照时间（B）和占空比（C）为自变量，以CSO提取率（R1）、CSP提取率（R2）和CSPS提取率（R3）为响应值，设计了三因素三水平的响应面试验，设计概要见表1。通过软件（Design Expert 8.0.6，USA）分析二次多项式模型的系数。使用ANOVA进行统计分析以获得UTPP的最佳条件。

表1 Box-Behnken试验设计因素和水平

2 试验结果与讨论

2.1 添加(NH4)2SO4的影响

在TPP系统中，(NH4)2SO4是最常用的盐析试剂，因为它便宜，对蛋白质温和，并且具有高溶解度[10]。如图1（A）所示，随着(NH4)2SO4的添加量从10 g/100 mL增加到50 g/100 mL，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率均呈现先增加后减少的趋势，这是因为盐析效应随着体系中盐浓度的增加而变得更强。(NH4)2SO4的最佳浓度将使蛋白质絮凝并将其分离到相间，最大限度地释放与蛋白质结合的脂质，从而最大限度地溶解叔丁醇相中的脂质[7]。因此，当(NH4)2SO4浓度为30 g/100 mL时，CSO提取率和CSP提取率最高，分别为38.99%和14.27%。然而，在较低的(NH4)2SO4添加量（20 g/100 mL）下，盐的增溶作用可以促进CSPS在下相中的有效分配。因此，当(NH4)2SO4的加入量为20 g/100 mL时，CSPS提取率最高，为2.05%。

图1 UTPP法测试参数对CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的影响

(NH4)2SO4浓度过高导致蛋白质不可逆变性，不利于油体中蛋白质和脂类的分离，导致CSO提取率和CSP提取率下降。同时，随着(NH4)2SO4添加量的增加，CSPS提取率也降低，这是因为随着盐离子浓度的增加，盐离子结合了更多的水分子，导致与水分子之间形成的氢键网络减弱，进而影响多糖的提取[7]。

(NH4)2SO4浓度为30 g/100 mL时，CSO提取率和CSP提取率最高，而(NH4)2SO4浓度为20 g/100 mL和30 g/100 mL时，CSPS提取率之间的差异不显著（P＞0.05）。因此，选择浓度为30 g/100 mL的(NH4)2SO4进行进一步研究。

2.2 叔丁醇与浆液比例的影响

叔丁醇是TPP中常见的溶剂，具有良好的水溶性，可以有效分离蛋白质、色素、脂质等各种生物分。如图1（B）所示，当叔丁醇与浆液的体积比从0.5∶1.0（mL/mL）增加到1.0∶1.0（mL/mL）时，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率逐渐增加。叔丁醇浓度的增加促使沉淀的蛋白质漂浮在下层水相（含水的盐层）之上，这促进了蛋白质与脂质和多糖的分离，同时促进了CSO在叔丁醇中的溶解。因此，当叔丁醇与浆液的体积比为1.0∶1.0（mL/mL）时，CSO、CSP和CSPS的提取率最高，分别为39.74%，14.17%和1.94%。

当叔丁醇与浆液的体积比继续增加到2.5∶1.0（mL/mL）时，CSO提取率没有显著变化，而CSP提取率和CSPS提取率均下降。这是因为大量叔丁醇导致蛋白质变性，这不利于蛋白质沉降到相间[8]。随着叔丁醇含量的增加，它与硫酸根离子竞争水分子，因此影响CSPS在下相中的溶解。结果表明，在浆液和叔丁醇的比例为1∶1时，可可脂替代品的提取率最高[9]。当叔丁醇与浆液的体积比为1.0∶1.0（mL/mL）时，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率达到最大值，因此选择叔丁醇与浆液的体积比1.0∶1.0（mL/mL）进行进一步研究。

2.3 pH的影响

UTPP的分离效率与pH的变化高度相关。由于pH的变化会影响大分子之间的静电相互作用，因此UTPP系统中蛋白质和多糖的分配会随着pH的变化而变化。在图1（C）中，随着pH从3增加到7，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率呈现出先增加后减少的趋势。在pH 5时，最大的CSO提取率和CSP提取率分别为38.99%和14.17%，而在pH 6时最大的CSPS提取率为2.06%。一些研究结果显示，CSP在pH约为5.0时溶解度最低。当体系pH约为5时，CSP的净电荷为零，蛋白质的沉淀量最大，有利于油体中油和蛋白质的分离，进而促进CSO在叔丁醇中的溶解。因此，CSO提取率和CSP提取率在pH 5时达到最大值。

随着pH的增加，蛋白质表面带负电荷，这将增加蛋白质在下层相中的溶解度，对油和蛋白质的提取不利。因此，随着pH继续增加，CSO提取率和CSP提取率逐渐降低。pH的变化也会影响与多糖结合的糖蛋白的分离，从而影响CSPS提取率。CSO提取率和CSP提取率在pH 5时达到最大值，而在pH 5和pH 6时对CSPS提取率的影响的可变性不显著（P＞0.05）。考虑到pH对CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的影响，选择pH 5作为研究的下一步。

2.4 超声波功率的影响

超声波功率对提取效率有积极的贡献。超声功率的增加放大了空化效应和机械剪切，促进了传质，有利于快速萃取。如图1（D）所示，随着超声功率从30 W增加到150 W，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率均呈现先增加后降低的趋势，当超声功率为120 W时，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率达到最高值，分别为38.99%，14.17%和1.94%，这是由超声波产生的声空化现象引起的。在超声波处理过程中，瞬态气泡在几个声学周期内迅速形成，当它们在介质中达到临界尺寸时会强烈破裂，这种现象增加了空化区域的局部压力，并在液体周围产生高剪切和湍流，这加速了传质过程[7,9-10]，因此有利于CSO、CSP和CSPS的提取。然而，当超声功率过高时，空化气泡剧烈破裂，导致空化效应的中断，因此CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率减少。CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率在120 W的超声功率下达到最大值。因此，选择120 W的超声功率用于进一步研究。

2.5 辐照时间的影响

研究了超声处理时间对CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的影响，结果显示在图1（E）中。如图1（E）所示，当超声处理时间为15 min时，CSP提取率达到最大值2.01%，而CSO提取率和CSPS提取率在超声处理时间为20 min时达到最高值，分别为38.99%和14.17%。超声波辅助提取可以在短时间内实现物质的有效提取，这是由于超声的瞬时空化效应破坏了生物膜和细胞壁，促进了溶剂和固体之间的有效接触，并使溶剂渗透到细胞中，从而加速了TPP的分离效率。因此，它有利于充分提取CSO，CSP和CSPS，并缩短提取时间[7,10]。CSO提取率和CSP提取率在照射时间为20 min时达到最大值。15和20 min的照射时间对细胞毒性的影响差异不显著（P＞0.05）。结合辐照时间对CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的影响，选择20 min的辐照时间用于进一步研究。

2.6 占空比的影响

考虑到换能器的腐蚀和由此产生的过热，研究人员不建议连续使用超声波。因此，为该系统选择超声波处理的脉冲模式，并表示为占空比。通过改变超声波开启和关闭时间来改变占空比。如图1（F）所示，当占空比从20%增加到100%时，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率都显示出先增加后减少的趋势。占空比为60%时，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率值最高，分别为38.99%，14.17%和1.94%。超声处理产生的空化气泡的破裂会在周围流体中引起高温、高压和微射流的瞬态。当占空比为20%（即脉冲间隔延长）时，微射流的这种状态迅速消失。因此，较低的占空比不利于CSO、CSP和CSPS的提取。当占空比增加时，系统中的固体和液体颗粒在超声处理下振荡并获得更快的速度，导致可溶性物质从原料快速扩散到溶剂中，从而促进CSO、CSP和CSPS的提取[8]。

超声作用引起的空泡溃灭可产生高达5 000 K的局部温度和高达1 000 MPa的压力。当占空比达到100%时，连续超声作用产生的热量难以迅速扩散，导致局部温度过高，不利于CSO、CSP和CSPS的提取。此外，使用脉冲超声治疗比连续超声治疗更节能。为了优化UTPP同时提取CSO、CSP和CSPS的超声处理参数，对超声功率、辐射时间和占空比三个自变量进行了响应面优化试验。其他操作条件：(NH4)2SO4的加入量为30 g/100 mL，叔丁醇与浆液的比例为1.0∶1.0（mL/mL），pH为5。

2.7 响应面法优化CSO、CSP和CSPS提取

2.7.1 干扰分析

将独立变量组合到响应曲线中，利用扰动图研究了这3个变量对CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的扰动影响。试验自变量对响应值的影响与曲线的斜率密切相关。斜率较大的响应曲线意味着相应的试验因子对响应值敏感，而斜率较小的曲线表明响应值对该因子不敏感。在绘制过程中，通过改变测试范围内的单个因素并固定其他因素来检查响应值与参考点的偏差。图2显示占空比和超声功率比照射时间对CSO提取率更敏感。图2中的曲线表明，照射时间和占空比对CSP提取率更敏感，对于CSPS提取率，照射时间最敏感，占空比不太敏感。

图2 测试参数对扰动的影响

2.7.2 响应面模型分析

采用BBD法对超声功率、辐射时间和占空比参数进行优化，得到最佳提取工艺条件。17次运行的试验数据和RSM模型的预测数据如表2所示，二次模型的ANOVA值如表3所示。如表3所示，“缺乏拟合P值”不显著（P＞0.05），回归分析显著，F值分别为84.12，88.06和30.25，表明三个因素与响应值之间存在显著的非线性关系。模型的R平方值分别为0.990 9，0.991 2和0.975 4，adj的R平方值分别为0.979 2，0.980 0和0.943 7，充分证明了模型与试验拟合良好。“Adeq精度”值分别为28.958，26.862和14.229，也表明该模型是理想的。所有三个模型的变异系数（C.V.）都小于5%，这代表了模型的良好再现性。

表2 RSM模型的测试数据和预测数据比较

表4 回归方程方差分析

2.7.3 UTPP法提取参数的优化

基于响应面法建立的数学模型，优化的试验条件为超声功率117.57 W，辐射时间19.75 min，占空比62.37%。在最佳条件下，预测值分别为39.85%，14.32%和1.99%。结合实际操作，将超声功率、辐照时间和占空比分别调整为118 W、20 min和60%。为了验证优化结果的可靠性，在调整后的条件下进行3次试验验证，得到的CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率分别为39.79%±1.54%，14.30%±0.37%和1.97%±0.13%。验证试验结果与预测值高度一致，表明该模型能有效预测试验结果。

3 结论

研究了用UTPP同时提取和分离葫芦籽油、蛋白质和多糖的效果。通过单因素试验和响应面法优化了硫酸铵添加量、叔丁醇与浆液的比例、pH、超声功率、辐射时间和占空比等参数，以实现CSO、CSP和CSPS的高效提取。当(NH4)2SO4加入量为30 g/100 mL，叔丁醇与浆料的比例为1.0∶1.0（mL/mL），pH为5，超声功率为118 W，辐射时间为20 min，占空比为60%时，获得最高的CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率。工艺分析和优化结果表明，占空比和超声功率对CSPS提取率的影响比辐照时间更敏感，占空比和辐照时间对CSP提取率的影响更敏感，辐照时间对CSPS提取率的影响最敏感。同时，试验结果与预测值吻合较好，表明该模型可用于指导实验设计。与TPP方法相比，UTPP方法提取时间缩短，UTPP方法提取的CSO质量较好。天然植物油一般具有抑制刺激，醇和烟香的作用；多糖具有改善口感，增加丰满度的作用。利用自主调香技术对葫芦籽油和葫芦籽多糖的香味特征进行了修饰及优化，进一步提升了葫芦籽油和葫芦籽多糖的品质和作为香精在卷烟中的实用性。